我们感谢埃文斯实验室的成员对这份手稿的深思熟虑的反馈。这项工作得到了杜克怀特黑德学者，杜克科学和技术学者和霍华德休斯医学研究所（HHMI）汉娜格雷奖学金的支持。 图1A 是使用 BioRender.com 制作的。

1. 生物样品的制备
注意：在生物安全柜中使用无菌技术执行以下步骤。用70%乙醇喷洒机柜表面和所有材料。
<ol><li>HeLa细胞培养和转染<ol><li>在Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）中培养30，000个HeLa细胞，含有4.5g / L葡萄糖，补充有10%胎牛血清和1%L-谷氨酰胺溶液（HeLa培养基;参见 材料表）。将细胞铺在含有 2 mL 预热 HeLa 培养基的 35 mm 玻璃底成像皿（参见材料 T 上）。将HeLa培养物保持在5%CO2 和37°C26，27。</li>
		<li>电镀后的第二天，使用光学显微镜检查35毫米成像皿，以确保细胞~50%-60%汇合。汇合后，用空的黄色荧光蛋白（YFP）载体，YFP-ParkinWT或YFP-ParkinT240R 转染HeLa细胞（图1A）。</li>
		<li>每次转染时，在无菌微量离心管中制备两种单独的混合物。通过敲击试管或轻轻上下移液进行混合。<ol><li>在管 1 中，将 200 μL 还原血清培养基（参见 材料表）与 2 μg 质粒 DNA 混合。</li>
			<li>在试管 2 中，将 200 μL 还原血清培养基与 6 μL 转染试剂混合（参见 材料表）28。</li>
		</ol></li>
		<li>将试管在室温（RT）下孵育5分钟。将管2加入管1中，通过上下移液混合，并在室温下孵育20分钟。</li>
		<li>将转染复合物滴加到含有HeLa细胞培养物的现有成像培养皿中，确保在整个培养皿中均匀分布。将成像培养皿置于5%CO2 和37°C培养箱中过夜。 注意：用适当的转染质粒标记每个培养皿。对于每个实验，标记三个YFP-ParkinWT 培养皿（二甲基亚砜[DMSO;见 材料表]，5μM CCCP和20μM CCCP）。用三个YFP-ParkinT240R 培养皿和三个空的YFP载体培养皿重复标签。</li>
	</ol></li>
	<li>CCCP和荧光染料的制备 注意：荧光染料通常对光敏感。使用铝箔或棕色离心管将染料存放在黑暗中，以减少暴露在光线下。<ol><li>通过将 5 mg CCCP 溶解在 4.89 mL DMSO 中，制备 5 mM 的 CCCP 工作储备液（参见 材料表）。通过将 5 mg CCCP 溶解在 1.22 mL DMSO 中，制备 20 mM 的 CCCP 工作储备液。</li>
		<li>在 390 μL DMSO 中稀释 10 μL 1 mM MitoTracker 深红色（参见 材料表）储备溶液，制成 25 μM 工作储备液。</li>
		<li>将 50 μg MitoSOX 红25 （参见 材料表）溶解在 13 μL DMSO 中，以创建 5 mM 工作储备液。</li>
		<li>将 10 mg TMRE24 （参见 材料表）溶解在 19.4 mL DMSO 中，制成 1 mM 储备溶液。通过将 10 μL 1 mM TMRE 加入 990 μL DMSO 中来稀释 TMRE，制成 10 μM 工作储备液。</li>
	</ol></li>
</ol>2. HeLa细胞中荧光探针的CCCP处理和线粒体标记
注意：快速执行以下步骤，以确保HeLa细胞不会长时间离开培养箱。
<ol><li>转染后第二天，向每个实验板中加入 2 μL 的 5 或 20 mM CCCP（终浓度：分别为 5 μM 和 20 μM）。对于对照板，加入 2 μL DMSO。将板返回到5%CO2 和37°C培养箱中1.5小时（图1A）。 注意：CCCP治疗总共2小时。然而，在CCCP治疗的最后30分钟内用荧光探针标记线粒体。</li>
	<li>1.5小时后，从培养箱中取出板并将荧光探针添加到成像培养皿中。将板返回到5%CO2 和37°C培养箱中30分钟（图1A）。<ol><li>TMRE 实验：加入 2 μL 25 μM MitoTracker（终浓度：25 nM）和 2 μL 10 μM TMRE（最终浓度：10 nM）。</li>
		<li>MitoSOX 实验：加入 2 μL 25 μM MitoTracker（终浓度：25 nM）和 1 μL 5 mM MitoSOX（最终浓度：2.5 μM）。</li>
	</ol></li>
	<li>在2小时CCCP处理后，准备HeLa细胞进行成像（图1A，B）。<ol><li>TMRE实验：HeLa细胞立即准备好成像;确保TMRE保留在HeLa细胞培养基中。</li>
		<li>MitoSOX 实验：用 2 mL 预热的 HeLa 培养基洗涤细胞 3 倍，以去除游离的 MitoSOX 染料。加入 2 mL 预热培养基。HeLa细胞现在已准备好成像。 注意：用新鲜的预热HeLa培养基洗涤HeLa细胞，该培养基含有与实验条件相同的DMSO或CCCP浓度;不包括 MitoSOX 或 MitoTracker。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 共聚焦显微镜图像采集设置
注意：使用配备63x/1.40数值孔径（NA）油浸物镜和环境室（见材料表）的共聚焦显微镜（见材料表）对HeLa细胞进行成像。
<ol><li>在成像前1小时，通过打开罐阀打开CO2。按开按钮打开显微镜的环境控制器。使用触摸板上的向上和向下箭头将温度调节到 37 °C，将 CO 2 调节到 5%。完成后按设置。 注意：确保环境室的门已关闭，并等待条件稳定下来。</li>
	<li>激光设置<ol><li>打开 白光激光器 （WLL）并将 激光 功率设置为 85%， 将 激发控制 设置为 最大功率。单击“ 获取 ”选项卡，选择 “添加激光器”，然后在出现的对话框中，将 WLL 切换为 “开”。单击 激光功率 按钮并输入 85%。单击 励磁控制 按钮，然后从下拉菜单中选择 最大功率 （图2A）。</li>
		<li>TMRE实验： 设置YFP，MitoTracker和TMRE的激发和发射光谱。<ol><li>对于YFP，将激发激光设置为514 nm，将发射光谱窗口设置为524-545 nm。 在“获取”选项卡中，单击“添加新设置”按钮;然后，单击添加激光并将其拖到设置 1 中。双击激发线并在对话框中输入 514 作为波长。双击相应的检测器，输入 524 作为起始波长，输入 545 作为结束波长。</li>
			<li>对于MitoTracker深红，将激发激光设置为641，将发射光谱窗口设置为650-750 nm。在“获取”选项卡中，单击“添加激光”按钮并将其拖到“设置1”中。双击激发线并在对话框中输入 641 作为波长。双击相应的检测器，输入 650 作为开始波长，输入 750 作为结束波长。</li>
			<li>对于TMRE，将激发激光设置为555 nm，将发射光谱窗口设置为557-643 nm。在“获取”选项卡中，单击“添加新设置”按钮;然后，点击 添加激光 按钮并将其拖到设置 2.双击激发线，然后在对话框中输入 555 作为波长。双击相应的检测器，输入 557 作为起始波长，输入 643 作为结束波长。</li>
		</ol></li>
		<li>MitoSOX 实验： 设置YFP，MitoTracker和MitoSOX的激发和发射光谱（图2B）。<ol><li>对于YFP，将激发激光设置为507 nm，将发射光谱窗口设置为517-540 nm。在“获取”选项卡中，单击“添加新设置”按钮;然后，单击 添加激光 按钮并将其拖到设置 1。双击激发线并在对话框中输入 507 作为波长。双击相应的检测器，输入 517 作为起始波长，输入 540 作为结束波长。</li>
			<li>对于 MitoSOX，将 激发 激光设置为 547 nm， 将发射 光谱窗口设置为 564-636 nm。在“ 获取 ”选项卡中，单击“ 添加新设置 ”按钮;然后，点击 添加激光 按钮并将其拖到 设置 2.双击 激发线并在对话框中输入 547 作为波长。双击相应的 检测器 ，输入 564 作为起始波长，输入 636 作为结束波长。</li>
			<li>对于MitoTracker深红，将激发激光设置为641 nm，将发射光谱窗口设置为652-742 nm。 在“获取”选项卡中，单击“添加新设置”按钮;点击 添加激光 按钮并将其拖到设置 3。双击激发线并在对话框中输入 641 作为波长。双击相应的检测器，输入 652 作为起始波长，输入 742 作为结束波长。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>图像采集设置（图2C）<ol><li>将 格式 设置为 1，024 x 1，024， 将扫描速度 设置为 600 Hz，将 线平均值 设置为 3。<ol><li>选择“ 采集”选项卡，然后单击“ 格式 ”按钮。从下拉菜单中，选择 1，024 x 1，024。单击 速度 按钮，然后从下拉菜单中选择 600 。然后，单击 线平均值 按钮，然后从下拉菜单中选择 3。</li>
			<li>打开 双向扫描 并将 相位 和 变焦系数 分别设置为 22.61 和 1.50。<ol><li>在“ 采集”选项卡中，将“ 双向 ”按钮切换为 “开”。单击 阶段 X 设置并将其设置为 22.61。单击 缩放系数 设置并将其设置为 1.50。</li>
			</ol></li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>4. 图像采集
注意：实验者必须根据YFP荧光信号做出视觉判断以选择细胞。避免像素过饱和，因为它们会显着影响荧光强度定量。使用指示像素饱和度的过/欠查找表，以避免获取饱和图像。
<ol><li>单击感兴趣的 设置 ，然后按快速实时以提供荧光图像的 实时预览。</li>
	<li>通过双击相应的检测器来调整增益和强度。在出现的对话框中，使用滑块调整增益。要更改强度，请双击激发线并使用弹出窗口中的向上和向下箭头更改强度。单击“停止”结束预览。<ol><li>TMRE实验：首先对DMSO控制板进行成像。调整TMRE信号的增益和强度（设置2），使线粒体网络强度略低于饱和度; 保持实验的增益和强度恒定。调整丝线虫追踪器和YFP的增益和强度（设置1），使线粒体网络可见但暗淡。</li>
		<li>MitoSOX 实验：首先对 DMSO 控制板进行成像。调整 MitoSOX（设置 2）信号的增益和强度，使荧光可见但暗淡;保持实验的增益和强度恒定。调整YFP（设置1）和MitoTracker（设置3）的增益和强度，使线粒体网络可见但暗淡。 注意：记录TMRE和MitoSOX的增益和强度，因为这些值在整个实验过程中必须保持不变。YFP和MitoTracker的荧光信号在该协议中未量化。因此，可以针对每个图像调整增益和强度。最有效的是具有增益和强度设置，其中细胞 易于看到但仍很暗，以确保细胞不会暴露在导致细胞损伤或光漂白的过度激光强度下。</li>
	</ol></li>
	<li>增益和强度设置完成后，单击 “开始 ”以获取图像。每个实验条件获取 20 个细胞的图像（例如，五个图像，每个图像四个细胞; 图 2D）。</li>
</ol>5. 使用 ImageJ 进行荧光强度定量
注意：图像文件保存为“.lif”，并与 ImageJ29 兼容。与 ImageJ 兼容的文件类型在其网站上指定。如果文件类型不兼容，则可能需要转换文件类型。
<ol><li>创建并保存感兴趣区域 （ROI）。<ol><li>在 ImageJ 中，单击“ 文件”|”新品 |图像。 在弹出的对话框中，单击“ 确定”。</li>
		<li>单击矩形工具按钮并绘制一个 6 微米 x 6 微米的框。通过单击“分析”|”工具 |ROI 管理器，然后等待出现带有 ROI 管理器的对话框（图 3A）。通过单击管理器对话框中的添加将矩形 ROI 添加到管理器。通过选择“更多”来保存投资回报率，然后单击“保存”按钮和“确定”。</li>
	</ol></li>
	<li>测量荧光强度。<ol><li>在图像 J 中，单击 文件 并选择 打开。在对话框中，选择实验的映像文件，然后单击“ 打开”。</li>
		<li>等待 “生物格式导入选项” 窗口出现（图3B）。选择 拆分通道 ，然后单击 打开。 注意：拆分通道功能允许将图像中的每个通道作为单独的窗口打开。通道顺序对应于获取顺序。<ol><li>TMRE 实验： YFP （设置 1）是第一个通道 （c = 0）; MitoTracker （设置 1）是第二个通道 （c = 1）;TMRE（设置 2）是第三个通道 （c = 2）。</li>
			<li>MitoSOX 实验： YFP （设置 1）是第一个通道 （c = 0）; MitoSOX （设置 2）是第二个通道 （c = 1）; MitoTracker （设置3）是第三个通道（c = 2）。</li>
		</ol></li>
		<li>通过选择 “图像 |调整 |亮度 （图3C）。 注：请勿按“ 设置”或 “应用”以确保图像亮度不会永久更改。有时，荧光强度在TMRE或MitoSOX通道中不可见。调整亮度以简化可视化。改变亮度不会影响原始荧光强度值。</li>
		<li>单击 分析 ，然后选择 设置测量。选中 面积 和 平均灰度值 框，然后单击 确定 （图 3D）。 注意：平均灰度值是荧光强度。</li>
		<li>打开 ROI 管理器 ，然后通过单击 “分析”|”工具 |投资回报率经理。在 ROI 管理器中，单击 更多， 然后从显示的列表中单击 打开，然后选择保存的 ROI。</li>
		<li>通过从ROI管理器中选择保存的ROI来测量单个细胞中五个随机区域的荧光强度，并将ROI移动到细胞内的随机位置（图3E）。按 M测量荧光强度。对另外四个不重叠区域重复此步骤。当出现包含面积和平均灰度值的对话框（图 3F）时，将这些值复制并粘贴到电子表格中进行分析。<ol><li>TMRE 实验：选择图像（c = 2）。</li>
			<li>MitoSOX 实验：选择图像 （c = 2）。</li>
		</ol></li>
		<li>获得平均荧光强度值。使用电子表格软件（参见 材料表），平均五个平均灰度值。对每个单元格重复此过程。</li>
		<li>使用统计软件程序分析和比较实验条件下的TMRE或MitoSOX平均灰度值（参见 材料表;图 4 和 图 5）。将数据显示为条形图或小提琴图。</li>
	</ol></li>
</ol>

线粒体膜电位和超氧化物水平的定量

作者没有竞争利益要声明。

此处概述的工作流程可用于使用基于荧光的成像稳定且可重复地量化线粒体膜电位和超氧化物水平30。在设计这些实验时，需要考虑重要的技术限制。用空的YFP载体YFP-ParkinWT或YFP-ParkinT240R转染HeLa细胞。空的YFP载体被用作对照，以确认实验结果是帕金特有的。对于瞬时转染，通过实验确定DNA与转染试剂的质量比为1：3，以产生最高的转染率，其中每个构建体使用2 μ...

线粒体网络是一系列相互连接的细胞器，在能量产生1，先天免疫2，3和细胞信号传导4，5中起着至关重要的作用。线粒体失调与帕金森病（PD）等神经退行性疾病有关6，7。PD是一种进行性神经退行性疾病，影响黑质的多巴胺能神经元，影响全球近1000万人8。PD与线粒体自噬有遗传联系，线粒体自噬是维持细胞稳态所必需的线粒体质量控制途径，选择性地去除受损的线粒体9，10。研究已经确定了多种独立的线粒体自噬途径，包括含有 1 （FUNDC1） 介导的线粒体自噬的 FUN14 结构域、Bcl-2 相互作用蛋白 3 （BNIP3） 促进的线粒体自噬、NIX 依赖性线粒体自噬以及特征明确的 PTEN 诱导激酶 1 （PINK1）/帕金调节线粒体自噬10，11。PINK1（一种假定的激酶）和帕金（一种E3泛素连接酶）与磷酸泛素受损线粒体协同工作，后者驱动自噬体的形成，吞噬受损细胞器并与溶酶体融合以启动降解12，13，14，15，16。帕金的突变与PD相关的表型有关，例如通过多巴胺能神经元丢失引起的神经变性17，18。
在这里，描述了一个协议，其中HeLa细胞，常规使用的源自宫颈癌的永生化细胞，用于研究Parkin在维持线粒体网络健康中的作用。HeLa细胞表达的内源性帕金水平可以忽略不计，因此需要外源性帕金表达19。为了研究Parkin在线粒体网络健康中的作用，用野生型Parkin（ParkinWT），Parkin突变体（ParkinT240R）或空对照载体转染HeLa细胞。ParkinT240R是一种常染色体隐性幼年帕金森综合征突变，影响Parkin E3连接酶活性，显着降低线粒体自噬途径的效率20。HeLa细胞暴露于轻度（5μM）或严重（20μM）浓度的羰基氰间氯苯基腙（CCCP），一种线粒体解偶联剂。用高浓度的CCCP处理通常用于在各种细胞系中诱导帕金介导的线粒体自噬，例如HeLa和COS-7细胞21，22，23。
治疗后，该方案使用两种当前可用的线粒体靶向荧光染料对线粒体网络进行实时成像。四甲基罗丹明、乙酯、高氯酸盐 （TMRE） 是一种阳离子染料，其荧光基于线粒体膜电位24，而 MitoSOX 是一种线粒体超氧化物指示剂，其中荧光强度是超氧化物浓度25 的函数。最后，概述的方案使用基于荧光的定量和简单的工作流程来有效地量化线粒体膜电位和超氧化物水平，而用户偏差的范围最小。尽管该协议旨在研究HeLa细胞中的线粒体功能，但它可以适用于其他细胞系和原代细胞类型，以定量表征线粒体网络健康。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO, Anhydrous</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGENE 6 (Tranfection Reagent)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution)&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoSOX&#160; Red&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M36008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Deep Red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M7514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (Redued Serum media)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental models: Organisms/Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa-M (Homo sapiens)</td>
			<td>A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EYFP Empty Vector</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP-Parkin T240R</td>
			<td>This Paper</td>
			<td>Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP-Parkin WT</td>
			<td>Addgene; PMID:19029340</td>
			<td>RRID:Addgene_23955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Illustrator</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td>https://www.adobe.com/products/illustrator</td>
			<td>(Schindelin, 2012)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel (Spreadsheet Software)</td>
			<td>Microsoft Office&#160;</td>
			<td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite (LAS X)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft Office</td>
			<td>https://www.microsoft.com/excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism9 (Statistical Analysis Software)</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>https://www.graphpad.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage Incubator (Environmental Chamber)</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>https://www.oko-lab.com/cage-incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMiL Inverted Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIGHTNING Deconvolution Software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STELLARIS 8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-based quantification of mitochondrial membrane potential and superoxide levels using live imaging in hela cells

线粒体是通过ATP合成 控制 能量产生，对代谢稳态至关重要的动态细胞器。为了支持细胞代谢，各种线粒体质量控制机制合作以维持健康的线粒体网络。其中一种途径是线粒体自噬，其中PTEN诱导的激酶1（PINK1）和受损线粒体的Parkin磷酸化泛素化促进自噬体隔离并随后通过溶酶体融合 从 细胞中去除。线粒体自噬对细胞稳态很重要，帕金的突变与帕金森病（PD）有关。由于这些发现，人们非常重视研究线粒体损伤和周转，以了解线粒体质量控制的分子机制和动力学。在这里，活细胞成像用于可视化HeLa细胞的线粒体网络，以量化线粒体解偶联剂羰基氰间氯苯基腙（CCCP）处理后的线粒体膜电位和超氧化物水平。此外，表达抑制帕金依赖性线粒体自噬的帕金PD连锁突变（ParkinT240R）以确定与表达野生型帕金的细胞相比突变如何影响线粒体网络。此处概述的方案描述了一种简单的工作流程，使用基于荧光的方法有效地量化线粒体膜电位和超氧化物水平。

The mitochondrial network is a series of interconnected organelles that play a crucial role in energy production1, innate immunity2,3, and cell signalling4,5. Mitochondrial dysregulation has been associated with neurodegenerative diseases such as Parkinson&#39;s disease (PD)6,7. PD is a progressive neurodegenerative disorder affecting dopaminergic neurons of the substantia nigra that impacts nearly 10 million people worldwide8. PD has been genetically linked to mitophagy, a mitochondrial quality control pathway necessary for maintaining cellular homeostasis that selectively removes damaged mitochondria9,10. Studies have identified multiple independent mitophagy pathways, including FUN14 domain containing 1 (FUNDC1)-mediated mitophagy, Bcl-2 interacting protein 3 (BNIP3)-facilitated mitophagy, NIX-dependent mitophagy, and the well-characterized PTEN-induced kinase 1 (PINK1)/Parkin-regulated mitophagy10,11. PINK1 (a putative kinase) and Parkin (an E3 ubiquitin ligase) work in tandem to phospho-ubiquitinate damaged mitochondria, which drives the formation of autophagosomes that engulf the damaged organelle and fuse with lysosomes to initiate degradation12,13,14,15,16. Mutations in Parkin have been associated with PD-linked phenotypes such as neurodegeneration via the loss of dopaminergic neurons17,18.
Here, a protocol is described in which HeLa cells, routinely used immortalized cells derived from cervical cancer, are used to investigate the role of Parkin in maintaining mitochondrial network health. HeLa cells express negligible levels of endogenous Parkin and therefore require exogenous Parkin expression19. To study the role of Parkin in mitochondrial network health, HeLa cells are transfected with either wild-type Parkin (ParkinWT), a Parkin mutant (ParkinT240R), or an empty control vector. ParkinT240R is an autosomal recessive juvenile parkinsonism mutation that affects Parkin E3 ligase activity, significantly reducing the efficiency of the mitophagy pathway20. HeLa cells are subject to mild (5 &#181;M) or severe (20 &#181;M) concentrations of carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP), a mitochondrial uncoupling agent. Treatment with severe concentrations of CCCP is routinely used to induce Parkin-mediated mitophagy in various cell lines, such as HeLa and COS-7 cells21,22,23.
Following treatment, the protocol employs live imaging of the mitochondrial network using two currently available mitochondrial-targeted fluorescent dyes. Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate (TMRE) is a cationic dye that fluoresces based on mitochondrial membrane potential24, while MitoSOX is a mitochondrial superoxide indicator where the fluorescence intensity is a function of superoxide concentration25. Finally, the outlined protocol uses a fluorescence-based quantification and simple workflow to effectively quantify the mitochondrial membrane potential and superoxide levels with minimal scope for user bias. Although this protocol was designed to study mitochondrial function in HeLa cells, it can be adapted for additional cell lines and primary cell types to quantitively characterize mitochondrial network health.

作者聚焦：在 HeLa 细胞中使用实时成像对线粒体膜电位和超氧化物水平进行基于荧光的定量  

使用HeLa细胞中的实时成像对线粒体膜电位和超氧化物水平进行基于荧光的定量

This research focuses on mitochondria dysregulation in neurodegenerative diseases. We believe that this research can be used to understand potential causes for disease onset that could lead to therapeutics combating neurodegenerative diseases like Parkinson's disease and ALS. Techniques such as super resolution microscopy like STED and SIM or expansion microscopy have improved the ability to accurately understand protein distribution within individual organelles and mitochondria distribution throughout the cell.Results of this technique can be used as a starting point to study the effect of Parkinson's disease linked mutations on mitochondrial turnover and begin to understand the importance of regulating reactive oxygen species levels and mitochondrial membrane potential to maintain neuronal health. Our laboratory aims to mechanistically characterize individual mitochondrial quality control pathways to understand the interplay between these pathways. By having insights into pathway dynamics, one can understand how mitochondria are maintained and how mitochondrial dysregulation contributes to neurodegenerative disease onset.

在该协议中，基于荧光的定量用于测量CCCP处理后线粒体网络的膜电位和超氧化物水平（图1）。该工作流程使用了HeLa细胞，这是一种源自宫颈癌的永生化细胞系。HeLa细胞通常用于研究线粒体生物学，并且相对平坦，因此很容易使用显微镜可视化线粒体网络。为了研究Parkin在维持线粒体网络健康中的作用，用空对照载体ParkinWT或ParkinT240R （一种破坏线粒体自噬...

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该技术描述了一种有效的工作流程，使用基于荧光的实时成像可视化和定量测量HeLa细胞内的线粒体膜电位和超氧化物水平。

Mitochondria are dynamic organelles critical for metabolic homeostasis by controlling energy production via ATP synthesis. To support cellular metabolism, ...

本研究的重点是神经退行性疾病中的线粒体失调。我们相信，这项研究可用于了解疾病发作的潜在原因，这些原因可能导致对抗帕金森病和ALS等神经退行性疾病的治疗方法。STED和SIM等超分辨率显微镜或扩增显微镜等技术提高了准确了解单个细胞器内的蛋白质分布和整个细胞线粒体分布的能力。该技术的结果可以作为研究帕金森病相关突变对线粒体周转影响的起点，并开始了解调节活性氧水平和线粒体膜电位对维持神经元健康的重要性。我们的实验室旨在机械地表征单个线粒体质量控制途径，以了解这些途径之间的相互作用。通过深入了解通路动力学，人们可以了解线粒体如何维持以及线粒体失调如何导致神经退行性疾病的发作。

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Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells

3.1K 次观看.  Duke University Medical Center. 本研究的重点是神经退行性疾病中的线粒体失调。我们相信，这项研究可用于了解疾病发作的潜在原因，这些原因可能导致对抗帕金森病和ALS等神经退行性疾病的治疗方法。STED和SIM等超分辨率显微镜或扩增显微镜等技术提高了准确了解单个细胞器内的蛋白质分布和整个细胞线粒体分布的能力。该技术的结果可以作为研究帕金森病相关突变对线粒体周转影响的起点，并开...

视频: 作者聚焦：在 HeLa 细胞中使用实时成像对线粒体膜电位和超氧化物水平进行基于荧光的定量  

Mitochondria are dynamic organelles critical for metabolic homeostasis by controlling energy production via ATP synthesis. To support cellular metabolism, various mitochondrial quality control mechanisms cooperate to maintain a healthy mitochondrial network. One such pathway is mitophagy, where PTEN-induced kinase 1 (PINK1) and Parkin phospho-ubiquitination of damaged mitochondria facilitate autophagosome sequestration and subsequent removal from the cell via lysosome fusion. Mitophagy is important for cellular homeostasis, and mutations in Parkin are linked to Parkinson's disease (PD). Due to these findings, there has been a significant emphasis on investigating mitochondrial damage and turnover to understand the molecular mechanisms and dynamics of mitochondrial quality control. Here, live-cell imaging was used to visualize the mitochondrial network of HeLa cells, to quantify the mitochondrial membrane potential and superoxide levels following treatment with carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP), a mitochondrial uncoupling agent. In addition, a PD-linked mutation of Parkin (ParkinT240R) that inhibits Parkin-dependent mitophagy was expressed to determine how mutant expression impacts the mitochondrial network compared to cells expressing wild-type Parkin. The protocol outlined here describes a simple workflow using fluorescence-based approaches to quantify mitochondrial membrane potential and superoxide levels effectively.

This technique describes an effective workflow to visualize and quantitatively measure mitochondrial membrane potential and superoxide levels within HeLa cells using fluorescence-based live imaging.

科研

生物学

Biological Samples Preparation for Confocal Microscopy, Image Acquisition Setup, and Confocal Microscopy Imaging

Begin by mixing 200 microliters of reduced serum media with two micrograms of any one plasmid DNA separately in a sterile micro centrifuge tube one. Repeat this for two other plasmids in separate tubes. Then in the new tube two, mix 200 microliters of reduced serum media with six microliters of transfection reagent and mix the contents by pipetting.Incubate the tubes for five minutes at room temperature before mixing the content of tube two to tube one. In separate tubes, repeat the mixing of the other two plasmids with a transfection reagent. Incubate the mixture for 20 minutes at room temperature.Next, drop-wise, add the transfection complexes to the HeLa cell culture-seeded imaging dishes, ensuring equal distribution across the entire dish. One hour before imaging, open the carbon dioxide tank valve and turn on the environmental controller for the microscope. Using the up and down arrows on the touch pad, adjust the temperature to 37 degrees Celsius and the carbon dioxide to 5%Press Set when complete.To adjust the laser settings, turn on the white light laser by clicking the Acquire tab and selecting Open Laser Overview. In the dialogue box, toggle the white light laser to on. Enter laser power as 85%Click the excitation control button and select maximum power from the dropdown menu.Begin the tetraethyl rhodamine ethyl ester percolate or TMRE, experiment by setting the excitation laser to 514 nanometers and the emission spectra window to 524 to 545 nanometers for YFP. Next, for MitoTracker Deep Red, set the excitation laser to 641 and the emission spectra window to 650 to 750 nanometers. Similarly, for TMRE, set the excitation laser to 555 nanometers and the emission spectra window to 557 to 643 nanometers.Begin the image acquisition setting by selecting the Acquisition tab and adjusting the format to 1024 by 1024. Adjust the speed to 600 in the dropdown menu. Then click the Line Average button and from the dropdown menu, select three.Turn bidirectional scanning on and set the phase and zoom factor to 22.61 and 1.50 respectively. Once done, select the cells based on the YFP fluorescent signal by clicking on the YFP setting one and pressing Fast Live. Then adjust the gain and intensity of YFP and then select cells based on the YFP fluorescent signal.To image the DMSO control plate in the TMRE experiment, adjust the gain and intensity of the TMRE signal setting two so that the mitochondrial network intensity is just below saturation. Keep the gain and intensity for TMRE constant. Then adjust the gain and intensity of the MitoTracker setting one so that the mitochondrial network is visible, but dim.Once the gain and intensity settings are complete, click Start to acquire an image. Acquire images of 20 cells per experimental condition.

用于共聚焦显微镜、图像采集设置和共聚焦显微镜成像的生物样品制备

Fluorescence Intensity Quantification of Transfected HeLa Cells Using ImageJ

To measure the fluorescence intensity of the transfected HeLa cells in ImageJ software, click file and select open. In the dialogue box, select the imaging files for the experiment and click okay. Once the bio-formats import options window appears, select split channels and click okay.In tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate, or TMRE experiments, YFP is the first channel, MitoTracker is the second channel and TMRE is the third channel. Adjust the brightness by selecting image, then adjust and then the brightness. Next, load the saved region of interest or ROI by clicking analyze, then tools, then ROI manager.In the ROI manager, click more, then open from the list and select the saved ROI. Then measure the fluorescent intensity of five random regions in a single cell by selecting the saved ROI from the ROI manager and moving the ROI to a random location within a cell. To measure the fluorescence intensity, press M on the keyboard and repeat this with four additional non-overlapping regions.When a dialogue box with the area and mean gray values appears, copy and paste the values into a spreadsheet for analysis. The results for the TMRE and MitoSOX fluorescence intensities showed that their treatment with the known uncoupling agent CCCP decreased the TMRE fluorescence intensity compared to the control conditions. In addition, 20 micromolar CCCP treatment induced superoxide production and increased the MitoSOX fluorescence intensity.In mild or five micromolar CCCP stress conditions, the expression of Parkin wild-type and Parkin T240R resulted in higher TMRE intensity compared to the empty YFP control vector. The MitoSOX intensity was lower in cells expressing Parkin wild-type and Parkin T240R compared to cells expressing the YFP control vector suggesting that Parking expression helps maintain the mitochondrial network health by preserving higher mitochondrial membrane potentials and low superoxide levels.