Evans laboratuvarı üyelerine bu makale hakkındaki düşünceli geri bildirimleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars ve Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Hanna Gray Fellowship tarafından desteklenmektedir. Şekil 1A , BioRender.com kullanılarak yapılmıştır.

Mitokondriyal Membran Potansiyeli ve Süperoksit Seviyelerinin Miktar Tayini

Yazarların beyan edecekleri rakip çıkarları yoktur.

Burada özetlenen iş akışı, floresan bazlı görüntüleme30 kullanılarak mitokondriyal membran potansiyelini ve süperoksit seviyelerini sağlam ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçmek için kullanılabilir. Bu deneyleri tasarlarken göz önünde bulundurulması gereken önemli teknik sınırlamalar vardır. HeLa hücreleri boş bir YFP vektörü, YFP-ParkinWT veya YFP-ParkinT240R ile transfekte edildi. Boş YFP vektörü, deneysel bulguların Parkin'e özgü olduğunu...

Mitokondriyal ağ, enerji üretimi 1, doğuştan gelen bağışıklık2,3 ve hücre sinyalizasyonu 4,5'te çok önemli bir rol oynayan birbirine bağlı bir dizi organeldir. Mitokondriyal disregülasyon, Parkinson hastalığı (PD) gibi nörodejeneratif hastalıklarla ilişkilendirilmiştir6,7. PH, dünya çapında yaklaşık 10 milyon insanı etkileyen, substantia nigra'nın dopaminerjik nöronlarını etkileyen ilerleyici bir nörodejeneratif hastalıktır8. PD, genetik olarak, hasarlı mitokondri 9,10'u seçici olarak ortadan kaldıran hücresel homeostazı korumak için gerekli bir mitokondriyal kalite kontrol yolu olan mitopajiye bağlanmıştır. Çalışmalar, 1 (FUNDC1) aracılı mitopaji içeren FUN14 alanı, Bcl-2 etkileşimli protein 3 (BNIP3) kolaylaştırılmış mitopaji, NIX'e bağımlı mitofaji ve iyi karakterize edilmiş PTEN-indüklenmiş kinaz 1 (PINK1) / Parkin tarafından düzenlenen mitopaji10,11 dahil olmak üzere birçok bağımsız mitopaji yolu tanımlamıştır. PINK1 (varsayılan bir kinaz) ve Parkin (bir E3 ubikitin ligaz), fosfo-ubikitinat hasarlı mitokondri ile birlikte çalışır, bu da hasarlı organeli içine çeken otofagozomların oluşumunu yönlendirir ve 12,13,14,15,16 bozulmasını başlatmak için lizozomlarla kaynaşır. Parkin'deki mutasyonlar, dopaminerjik nöronların kaybı yoluyla nörodejenerasyon gibi PD'ye bağlı fenotiplerle ilişkilendirilmiştir17,18.
Burada, rutin olarak kullanılan HeLa hücrelerinin, rahim ağzı kanserinden türetilen ölümsüzleştirilmiş hücrelerin, Parkin'in mitokondriyal ağ sağlığını korumadaki rolünü araştırmak için kullanıldığı bir protokol açıklanmaktadır. HeLa hücreleri ihmal edilebilir seviyelerde endojen Parkin eksprese eder ve bu nedenle eksojen Parkin ekspresyonugerektirir 19. Parkin'in mitokondriyal ağ sağlığındaki rolünü incelemek için, HeLa hücreleri vahşi tip Parkin (ParkinWT), bir Parkin mutantı (ParkinT240R) veya boş bir kontrol vektörü ile transfekte edilir. ParkinT240R, Parkin E3 ligaz aktivitesini etkileyen, mitopaji yolu20'nin etkinliğini önemli ölçüde azaltan otozomal resesif geçişli bir juvenil parkinsonizm mutasyonudur. HeLa hücreleri, mitokondriyal ayrıştırıcı bir ajan olan hafif (5 μM) veya şiddetli (20 μM) karbonil siyanür m-klorofenil hidrazon (CCCP) konsantrasyonlarına maruz kalır. Şiddetli CCCP konsantrasyonları ile tedavi, HeLa ve COS-7 hücreleri21,22,23 gibi çeşitli hücre hatlarında Parkin aracılı mitopajiyi indüklemek için rutin olarak kullanılır.
Tedaviyi takiben, protokol şu anda mevcut olan iki mitokondriyal hedefli floresan boya kullanarak mitokondriyal ağın canlı görüntülemesini kullanır. Tetrametilrhodamin, etil ester, perklorat (TMRE), mitokondriyal membran potansiyeli24'e dayanan floresan katyonik bir boyadır, MitoSOX ise floresan yoğunluğunun süperoksit konsantrasyonu25'in bir fonksiyonu olduğu mitokondriyal bir süperoksit göstergesidir. Son olarak, özetlenen protokol, kullanıcı yanlılığı için minimum kapsamla mitokondriyal membran potansiyelini ve süperoksit seviyelerini etkili bir şekilde ölçmek için floresan tabanlı bir niceleme ve basit bir iş akışı kullanır. Bu protokol, HeLa hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonu incelemek için tasarlanmış olmasına rağmen, mitokondriyal ağ sağlığını nicel olarak karakterize etmek için ek hücre hatları ve birincil hücre tipleri için uyarlanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO, Anhydrous</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGENE 6 (Tranfection Reagent)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution)&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoSOX&#160; Red&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M36008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Deep Red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M7514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (Redued Serum media)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental models: Organisms/Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa-M (Homo sapiens)</td>
			<td>A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EYFP Empty Vector</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP-Parkin T240R</td>
			<td>This Paper</td>
			<td>Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP-Parkin WT</td>
			<td>Addgene; PMID:19029340</td>
			<td>RRID:Addgene_23955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Illustrator</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td>https://www.adobe.com/products/illustrator</td>
			<td>(Schindelin, 2012)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel (Spreadsheet Software)</td>
			<td>Microsoft Office&#160;</td>
			<td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite (LAS X)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft Office</td>
			<td>https://www.microsoft.com/excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism9 (Statistical Analysis Software)</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>https://www.graphpad.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage Incubator (Environmental Chamber)</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>https://www.oko-lab.com/cage-incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMiL Inverted Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIGHTNING Deconvolution Software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STELLARIS 8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-based quantification of mitochondrial membrane potential and superoxide levels using live imaging in hela cells

Mitokondri, ATP sentezi yoluyla enerji üretimini kontrol ederek metabolik homeostaz için kritik öneme sahip dinamik organellerdir. Hücresel metabolizmayı desteklemek için, çeşitli mitokondriyal kalite kontrol mekanizmaları sağlıklı bir mitokondriyal ağı korumak için işbirliği yapar. Böyle bir yolak, PTEN'e bağlı kinaz 1 (PINK1) ve hasarlı mitokondrinin Parkin fosfo-ubikitinasyonunun otofagozom sekestrasyonunu ve daha sonra lizozom füzyonu yoluyla hücreden çıkarılmasını kolaylaştırdığı mitopajidir. Mitopaji, hücresel homeostaz için önemlidir ve Parkin'deki mutasyonlar Parkinson hastalığı (PD) ile bağlantılıdır. Bu bulgular nedeniyle, mitokondriyal kalite kontrolün moleküler mekanizmalarını ve dinamiklerini anlamak için mitokondriyal hasar ve cironun araştırılmasına önemli bir vurgu yapılmıştır. Burada, HeLa hücrelerinin mitokondriyal ağını görselleştirmek, mitokondriyal membran potansiyelini ve süperoksit seviyelerini ölçmek için canlı hücre görüntüleme, bir mitokondriyal ayrıştırıcı ajan olan karbonil siyanür m-klorofenil hidrazon (CCCP) ile tedaviyi takiben kullanıldı. Ek olarak, Parkin'e bağımlı mitopajiyi inhibe eden PD'ye bağlı bir Parkin mutasyonu (ParkinT240R), mutant ekspresyonun, vahşi tip Parkin'i eksprese eden hücrelere kıyasla mitokondriyal ağı nasıl etkilediğini belirlemek için ifade edildi. Burada özetlenen protokol, mitokondriyal membran potansiyelini ve süperoksit seviyelerini etkili bir şekilde ölçmek için floresan tabanlı yaklaşımlar kullanan basit bir iş akışını açıklamaktadır.

The mitochondrial network is a series of interconnected organelles that play a crucial role in energy production1, innate immunity2,3, and cell signalling4,5. Mitochondrial dysregulation has been associated with neurodegenerative diseases such as Parkinson&#39;s disease (PD)6,7. PD is a progressive neurodegenerative disorder affecting dopaminergic neurons of the substantia nigra that impacts nearly 10 million people worldwide8. PD has been genetically linked to mitophagy, a mitochondrial quality control pathway necessary for maintaining cellular homeostasis that selectively removes damaged mitochondria9,10. Studies have identified multiple independent mitophagy pathways, including FUN14 domain containing 1 (FUNDC1)-mediated mitophagy, Bcl-2 interacting protein 3 (BNIP3)-facilitated mitophagy, NIX-dependent mitophagy, and the well-characterized PTEN-induced kinase 1 (PINK1)/Parkin-regulated mitophagy10,11. PINK1 (a putative kinase) and Parkin (an E3 ubiquitin ligase) work in tandem to phospho-ubiquitinate damaged mitochondria, which drives the formation of autophagosomes that engulf the damaged organelle and fuse with lysosomes to initiate degradation12,13,14,15,16. Mutations in Parkin have been associated with PD-linked phenotypes such as neurodegeneration via the loss of dopaminergic neurons17,18.
Here, a protocol is described in which HeLa cells, routinely used immortalized cells derived from cervical cancer, are used to investigate the role of Parkin in maintaining mitochondrial network health. HeLa cells express negligible levels of endogenous Parkin and therefore require exogenous Parkin expression19. To study the role of Parkin in mitochondrial network health, HeLa cells are transfected with either wild-type Parkin (ParkinWT), a Parkin mutant (ParkinT240R), or an empty control vector. ParkinT240R is an autosomal recessive juvenile parkinsonism mutation that affects Parkin E3 ligase activity, significantly reducing the efficiency of the mitophagy pathway20. HeLa cells are subject to mild (5 &#181;M) or severe (20 &#181;M) concentrations of carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP), a mitochondrial uncoupling agent. Treatment with severe concentrations of CCCP is routinely used to induce Parkin-mediated mitophagy in various cell lines, such as HeLa and COS-7 cells21,22,23.
Following treatment, the protocol employs live imaging of the mitochondrial network using two currently available mitochondrial-targeted fluorescent dyes. Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate (TMRE) is a cationic dye that fluoresces based on mitochondrial membrane potential24, while MitoSOX is a mitochondrial superoxide indicator where the fluorescence intensity is a function of superoxide concentration25. Finally, the outlined protocol uses a fluorescence-based quantification and simple workflow to effectively quantify the mitochondrial membrane potential and superoxide levels with minimal scope for user bias. Although this protocol was designed to study mitochondrial function in HeLa cells, it can be adapted for additional cell lines and primary cell types to quantitively characterize mitochondrial network health.

Yazar Gündemi: HeLa Hücrelerinde Canlı Görüntüleme Kullanılarak Mitokondriyal Membran Potansiyelinin ve Süperoksit Seviyelerinin Floresan Tabanlı Miktar Tayini  

HeLa hücrelerinde canlı görüntüleme kullanılarak mitokondriyal membran potansiyelinin ve süperoksit seviyelerinin floresan bazlı ölçümü

Bu protokolde, CCCP tedavisini takiben mitokondriyal ağın membran potansiyelini ve süperoksit seviyelerini ölçmek için floresan bazlı niceleme kullanılmıştır (Şekil 1). Bu iş akışı, rahim ağzı kanserinden türetilen ölümsüzleştirilmiş bir hücre hattı olan HeLa hücrelerini kullandı. HeLa hücreleri mitokondriyal biyolojiyi incelemek için rutin olarak kullanılır ve nispeten düzdür, bu da mikroskopi kullanarak mitokondriyal ağı görselleştirmeyi kolaylaştır?...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells at JoVE.com

Bu teknik, floresan tabanlı canlı görüntüleme kullanarak HeLa hücrelerindeki mitokondriyal membran potansiyelini ve süperoksit seviyelerini görselleştirmek ve nicel olarak ölçmek için etkili bir iş akışını tanımlar.

Mitochondria are dynamic organelles critical for metabolic homeostasis by controlling energy production via ATP synthesis. To support cellular metabolism, ...

Bu araştırma nörodejeneratif hastalıklarda mitokondri disregülasyonuna odaklanmaktadır. Bu araştırmanın, Parkinson hastalığı ve ALS gibi nörodejeneratif hastalıklarla mücadelede terapötiklere yol açabilecek hastalık başlangıcının potansiyel nedenlerini anlamak için kullanılabileceğine inanıyoruz. STED ve SIM gibi süper çözünürlüklü mikroskopi veya genleşme mikroskobu gibi teknikler, bireysel organeller içindeki protein dağılımını ve hücre boyunca mitokondri dağılımını doğru bir şekilde anlama yeteneğini geliştirmiştir.Bu tekniğin sonuçları, Parkinson hastalığına bağlı mutasyonların mitokondriyal döngü üzerindeki etkisini incelemek ve nöronal sağlığı korumak için reaktif oksijen türü seviyelerini ve mitokondriyal membran potansiyelini düzenlemenin önemini anlamaya başlamak için bir başlangıç noktası olarak kullanılabilir. Laboratuvarımız, bu yollar arasındaki etkileşimi anlamak için bireysel mitokondriyal kalite kontrol yollarını mekanik olarak karakterize etmeyi amaçlamaktadır. Yol dinamikleri hakkında fikir sahibi olarak, mitokondrinin nasıl korunduğu ve mitokondriyal disregülasyonun nörodejeneratif hastalık başlangıcına nasıl katkıda bulunduğu anlaşılabilir.

fluorescence-based-quantification-mitochondrial-membrane-potential

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells

3.3K Görüntüleme.  Duke University Medical Center. Bu araştırma nörodejeneratif hastalıklarda mitokondri disregülasyonuna odaklanmaktadır. Bu araştırmanın, Parkinson hastalığı ve ALS gibi nörodejeneratif hastalıklarla mücadelede terapötiklere yol açabilecek hastalık başlangıcının potansiyel nedenlerini anlamak için kullanılabileceğine inanıyoruz. STED ve SIM gibi süper çözünürlüklü mikroskopi veya genleşme mikroskobu gibi teknikler, bireysel organeller içindeki protein dağılımını ve hücre boyunca mitok...

Video: Yazar Gündemi: HeLa Hücrelerinde Canlı Görüntüleme Kullanılarak Mitokondriyal Membran Potansiyelinin ve Süperoksit Seviyelerinin Floresan Tabanlı Miktar Tayini  

Mitochondria are dynamic organelles critical for metabolic homeostasis by controlling energy production via ATP synthesis. To support cellular metabolism, various mitochondrial quality control mechanisms cooperate to maintain a healthy mitochondrial network. One such pathway is mitophagy, where PTEN-induced kinase 1 (PINK1) and Parkin phospho-ubiquitination of damaged mitochondria facilitate autophagosome sequestration and subsequent removal from the cell via lysosome fusion. Mitophagy is important for cellular homeostasis, and mutations in Parkin are linked to Parkinson's disease (PD). Due to these findings, there has been a significant emphasis on investigating mitochondrial damage and turnover to understand the molecular mechanisms and dynamics of mitochondrial quality control. Here, live-cell imaging was used to visualize the mitochondrial network of HeLa cells, to quantify the mitochondrial membrane potential and superoxide levels following treatment with carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP), a mitochondrial uncoupling agent. In addition, a PD-linked mutation of Parkin (ParkinT240R) that inhibits Parkin-dependent mitophagy was expressed to determine how mutant expression impacts the mitochondrial network compared to cells expressing wild-type Parkin. The protocol outlined here describes a simple workflow using fluorescence-based approaches to quantify mitochondrial membrane potential and superoxide levels effectively.

This technique describes an effective workflow to visualize and quantitatively measure mitochondrial membrane potential and superoxide levels within HeLa cells using fluorescence-based live imaging.