Agradecemos a los miembros del laboratorio de Evans por sus comentarios reflexivos sobre este manuscrito. Este trabajo cuenta con el apoyo de Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars y Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Hanna Gray Fellowship. La Figura 1A se realizó utilizando BioRender.com.

Cuantificación del potencial de membrana mitocondrial y los niveles de superóxido

Los autores no tienen intereses contrapuestos que declarar.

El flujo de trabajo descrito aquí se puede utilizar para cuantificar el potencial de la membrana mitocondrial y los niveles de superóxido de forma robusta y reproducible utilizando imágenes basadas en fluorescencia30. Existen importantes limitaciones técnicas a considerar al diseñar estos experimentos. Las células HeLa se transfectaron con un vector YFP vacío, YFP-ParkinWT o YFP-ParkinT240R. El vector YFP vacío se utilizó como control para confirmar que los hallazgos...

La red mitocondrial es una serie de orgánulos interconectados que desempeñan un papel crucial en la producción de energía1, la inmunidad innata 2,3 y la señalización celular 4,5. La desregulación mitocondrial se ha asociado con enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson (EP)6,7. La EP es un trastorno neurodegenerativo progresivo que afecta a las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra y que afecta a casi 10 millones de personas en todo el mundo8. La EP se ha relacionado genéticamente con la mitofagia, una vía de control de calidad mitocondrial necesaria para mantener la homeostasis celular que elimina selectivamente las mitocondrias dañadas 9,10. Los estudios han identificado múltiples vías de mitofagia independientes, incluida la mitofagia mediada por el dominio FUN14 que contiene 1 (FUNDC1), la mitofagia facilitada por la proteína 3 que interactúa con Bcl-2 (BNIP3), la mitofagia dependiente de NIX y la bien caracterizada quinasa 1 inducida por PTEN (PINK1) / mitofagia regulada por Parkin10,11. PINK1 (una quinasa putativa) y Parkin (una ubiquitina ligasa E3) trabajan en conjunto para fosfo-ubiquitinar las mitocondrias dañadas, lo que impulsa la formación de autofagosomas que engullen el orgánulo dañado y se fusionan con los lisosomas para iniciar la degradación 12,13,14,15,16. Las mutaciones en Parkin se han asociado con fenotipos ligados a la EP, como la neurodegeneración a través de la pérdida de neuronas dopaminérgicas17,18.
Aquí, se describe un protocolo en el que las células HeLa, células inmortalizadas utilizadas rutinariamente derivadas del cáncer cervical, se utilizan para investigar el papel de Parkin en el mantenimiento de la salud de la red mitocondrial. Las células HeLa expresan niveles insignificantes de Parkin endógeno y, por lo tanto, requieren expresión exógena de Parkin19. Para estudiar el papel de Parkin en la salud de la red mitocondrial, las células HeLa se transectan con Parkin de tipo salvaje (ParkinWT), un mutante Parkin (ParkinT240R) o un vector de control vacío. ParkinT240R es una mutación de parkinsonismo juvenil autosómico recesivo que afecta a la actividad de la ligasa Parkin E3, reduciendo significativamente la eficiencia de la vía de mitofagia20. Las células HeLa están sujetas a concentraciones leves (5 μM) o graves (20 μM) de cianuro de carbonilo m-clorofenil hidrazona (CCCP), un agente de desacoplamiento mitocondrial. El tratamiento con concentraciones severas de CCCP se utiliza rutinariamente para inducir mitofagia mediada por Parkin en varias líneas celulares, como las células HeLa y COS-721,22,23.
Después del tratamiento, el protocolo emplea imágenes en vivo de la red mitocondrial utilizando dos tintes fluorescentes dirigidos a mitocondriales actualmente disponibles. La tetrametilrodamina, éster etílico, perclorato (TMRE) es un colorante catiónico que emite fluorescencia en función del potencial de membrana mitocondrial24, mientras que MitoSOX es un indicador de superóxido mitocondrial donde la intensidad de fluorescencia es una función de la concentración de superóxido25. Finalmente, el protocolo descrito utiliza una cuantificación basada en fluorescencia y un flujo de trabajo simple para cuantificar de manera efectiva el potencial de membrana mitocondrial y los niveles de superóxido con un alcance mínimo para el sesgo del usuario. Aunque este protocolo fue diseñado para estudiar la función mitocondrial en células HeLa, se puede adaptar para líneas celulares adicionales y tipos de células primarias para caracterizar cuantitativamente la salud de la red mitocondrial.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO, Anhydrous</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGENE 6 (Tranfection Reagent)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution)&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoSOX&#160; Red&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M36008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Deep Red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M7514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (Redued Serum media)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental models: Organisms/Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa-M (Homo sapiens)</td>
			<td>A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EYFP Empty Vector</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP-Parkin T240R</td>
			<td>This Paper</td>
			<td>Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP-Parkin WT</td>
			<td>Addgene; PMID:19029340</td>
			<td>RRID:Addgene_23955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Illustrator</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td>https://www.adobe.com/products/illustrator</td>
			<td>(Schindelin, 2012)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel (Spreadsheet Software)</td>
			<td>Microsoft Office&#160;</td>
			<td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite (LAS X)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft Office</td>
			<td>https://www.microsoft.com/excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism9 (Statistical Analysis Software)</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>https://www.graphpad.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage Incubator (Environmental Chamber)</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>https://www.oko-lab.com/cage-incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMiL Inverted Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIGHTNING Deconvolution Software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STELLARIS 8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-based quantification of mitochondrial membrane potential and superoxide levels using live imaging in hela cells

Las mitocondrias son orgánulos dinámicos críticos para la homeostasis metabólica mediante el control de la producción de energía a través de la síntesis de ATP. Para apoyar el metabolismo celular, varios mecanismos de control de calidad mitocondrial cooperan para mantener una red mitocondrial saludable. Una de estas vías es la mitofagia, donde la quinasa 1 inducida por PTEN (PINK1) y la fosfoubiquitinación Parkin de las mitocondrias dañadas facilitan el secuestro de autofagosomas y la posterior eliminación de la célula a través de la fusión de lisosomas. La mitofagia es importante para la homeostasis celular, y las mutaciones en Parkin están relacionadas con la enfermedad de Parkinson (EP). Debido a estos hallazgos, ha habido un énfasis significativo en la investigación del daño mitocondrial y el recambio para comprender los mecanismos moleculares y la dinámica del control de calidad mitocondrial. Aquí, se utilizaron imágenes de células vivas para visualizar la red mitocondrial de células HeLa, para cuantificar el potencial de membrana mitocondrial y los niveles de superóxido después del tratamiento con cianuro de carbonilo m-clorofenil hidrazona (CCCP), un agente de desacoplamiento mitocondrial. Además, se expresó una mutación ligada a la PD de Parkin (ParkinT240R) que inhibe la mitofagia dependiente de Parkin para determinar cómo la expresión mutante afecta la red mitocondrial en comparación con las células que expresan Parkin de tipo salvaje. El protocolo descrito aquí describe un flujo de trabajo simple que utiliza enfoques basados en fluorescencia para cuantificar el potencial de la membrana mitocondrial y los niveles de superóxido de manera efectiva.

The mitochondrial network is a series of interconnected organelles that play a crucial role in energy production1, innate immunity2,3, and cell signalling4,5. Mitochondrial dysregulation has been associated with neurodegenerative diseases such as Parkinson&#39;s disease (PD)6,7. PD is a progressive neurodegenerative disorder affecting dopaminergic neurons of the substantia nigra that impacts nearly 10 million people worldwide8. PD has been genetically linked to mitophagy, a mitochondrial quality control pathway necessary for maintaining cellular homeostasis that selectively removes damaged mitochondria9,10. Studies have identified multiple independent mitophagy pathways, including FUN14 domain containing 1 (FUNDC1)-mediated mitophagy, Bcl-2 interacting protein 3 (BNIP3)-facilitated mitophagy, NIX-dependent mitophagy, and the well-characterized PTEN-induced kinase 1 (PINK1)/Parkin-regulated mitophagy10,11. PINK1 (a putative kinase) and Parkin (an E3 ubiquitin ligase) work in tandem to phospho-ubiquitinate damaged mitochondria, which drives the formation of autophagosomes that engulf the damaged organelle and fuse with lysosomes to initiate degradation12,13,14,15,16. Mutations in Parkin have been associated with PD-linked phenotypes such as neurodegeneration via the loss of dopaminergic neurons17,18.
Here, a protocol is described in which HeLa cells, routinely used immortalized cells derived from cervical cancer, are used to investigate the role of Parkin in maintaining mitochondrial network health. HeLa cells express negligible levels of endogenous Parkin and therefore require exogenous Parkin expression19. To study the role of Parkin in mitochondrial network health, HeLa cells are transfected with either wild-type Parkin (ParkinWT), a Parkin mutant (ParkinT240R), or an empty control vector. ParkinT240R is an autosomal recessive juvenile parkinsonism mutation that affects Parkin E3 ligase activity, significantly reducing the efficiency of the mitophagy pathway20. HeLa cells are subject to mild (5 &#181;M) or severe (20 &#181;M) concentrations of carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP), a mitochondrial uncoupling agent. Treatment with severe concentrations of CCCP is routinely used to induce Parkin-mediated mitophagy in various cell lines, such as HeLa and COS-7 cells21,22,23.
Following treatment, the protocol employs live imaging of the mitochondrial network using two currently available mitochondrial-targeted fluorescent dyes. Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate (TMRE) is a cationic dye that fluoresces based on mitochondrial membrane potential24, while MitoSOX is a mitochondrial superoxide indicator where the fluorescence intensity is a function of superoxide concentration25. Finally, the outlined protocol uses a fluorescence-based quantification and simple workflow to effectively quantify the mitochondrial membrane potential and superoxide levels with minimal scope for user bias. Although this protocol was designed to study mitochondrial function in HeLa cells, it can be adapted for additional cell lines and primary cell types to quantitively characterize mitochondrial network health.

Autor destacado: Cuantificación basada en fluorescencia del potencial de membrana mitocondrial y los niveles de superóxido utilizando imágenes en vivo en células HeLa  

Cuantificación basada en fluorescencia del potencial de membrana mitocondrial y los niveles de superóxido utilizando imágenes en vivo en células HeLa

This research focuses on mitochondria dysregulation in neurodegenerative diseases. We believe that this research can be used to understand potential causes for disease onset that could lead to therapeutics combating neurodegenerative diseases like Parkinson's disease and ALS. Techniques such as super resolution microscopy like STED and SIM or expansion microscopy have improved the ability to accurately understand protein distribution within individual organelles and mitochondria distribution throughout the cell.Results of this technique can be used as a starting point to study the effect of Parkinson's disease linked mutations on mitochondrial turnover and begin to understand the importance of regulating reactive oxygen species levels and mitochondrial membrane potential to maintain neuronal health. Our laboratory aims to mechanistically characterize individual mitochondrial quality control pathways to understand the interplay between these pathways. By having insights into pathway dynamics, one can understand how mitochondria are maintained and how mitochondrial dysregulation contributes to neurodegenerative disease onset.

En este protocolo, se utilizó la cuantificación basada en fluorescencia para medir el potencial de membrana y los niveles de superóxido de la red mitocondrial después del tratamiento con CCCP (Figura 1). Este flujo de trabajo utilizó células HeLa, una línea celular inmortalizada derivada del cáncer cervical. Las células HeLa se utilizan rutinariamente para estudiar la biología mitocondrial y son relativamente planas, lo que facilita la visualización de la red mitocondrial mediante...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells at JoVE.com

Esta técnica describe un flujo de trabajo efectivo para visualizar y medir cuantitativamente el potencial de la membrana mitocondrial y los niveles de superóxido dentro de las células HeLa utilizando imágenes en vivo basadas en fluorescencia.

Mitochondria are dynamic organelles critical for metabolic homeostasis by controlling energy production via ATP synthesis. To support cellular metabolism, ...

Esta investigación se centra en la desregulación de las mitocondrias en enfermedades neurodegenerativas. Creemos que esta investigación se puede utilizar para comprender las posibles causas de la aparición de enfermedades que podrían conducir a terapias para combatir enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson y la ELA. Técnicas como la microscopía de súper resolución como STED y SIM o la microscopía de expansión han mejorado la capacidad de comprender con precisión la distribución de proteínas dentro de los orgánulos individuales y la distribución de las mitocondrias en toda la célula.Los resultados de esta técnica se pueden utilizar como punto de partida para estudiar el efecto de las mutaciones vinculadas a la enfermedad de Parkinson en el recambio mitocondrial y comenzar a comprender la importancia de regular los niveles de especies reactivas de oxígeno y el potencial de la membrana mitocondrial para mantener la salud neuronal. Nuestro laboratorio tiene como objetivo caracterizar mecánicamente las vías individuales de control de calidad mitocondrial para comprender la interacción entre estas vías. Al tener información sobre la dinámica de las vías, uno puede entender cómo se mantienen las mitocondrias y cómo la desregulación mitocondrial contribuye al inicio de la enfermedad neurodegenerativa.

fluorescence-based-quantification-mitochondrial-membrane-potential

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells

3.1K vistas.  Duke University Medical Center. Esta investigación se centra en la desregulación de las mitocondrias en enfermedades neurodegenerativas. Creemos que esta investigación se puede utilizar para comprender las posibles causas de la aparición de enfermedades que podrían conducir a terapias para combatir enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson y la ELA. Técnicas como la microscopía de súper resolución como STED y SIM o la microscopía de expansión han mejorado la capacidad de comprender con preci...

Video: Autor destacado: Cuantificación basada en fluorescencia del potencial de membrana mitocondrial y los niveles de superóxido utilizando imágenes en vivo en células HeLa  