이 원고에 대한 사려 깊은 피드백을 주신 Evans 연구실 구성원들에게 감사드립니다. 이 작업은 Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars 및 Howard Hughes Medical Institute(HHMI) Hanna Gray Fellowship의 지원을 받습니다. 도 1A 는 BioRender.com 를 사용하여 만들어졌다.

미토콘드리아 막 전위와 과산화물 수준의 정량화

저자는 선언 할 경쟁 이익이 없습니다.

여기에 요약된 워크플로우는 형광 기반 이미징을 사용하여 미토콘드리아 막 전위와 슈퍼옥사이드 수준을 강력하고 재현성 있게 정량화하는 데 사용할 수 있습니다(30). 이러한 실험을 설계할 때 고려해야 할 중요한 기술적 제한 사항이 있습니다. HeLa 세포를 빈 YFP 벡터, YFP-ParkinWT, 또는 YFP-ParkinT240R로 형질감염시켰다. 실험 결과가 파킨에 특이적인지 확인하기 위?...

미토콘드리아 네트워크는 에너지 생산1, 선천면역2,3, 세포신호전달4,5에 중요한 역할을 하는 일련의 상호 연결된 세포기관이다. 미토콘드리아 조절 장애는 파킨슨병(PD)과 같은 신경퇴행성 질환과 관련이 있습니다6,7. PD는 전 세계적으로 거의 1,000만 명에게 영향을 미치는 흑질의 도파민성 뉴런에 영향을 미치는 진행성 신경퇴행성 장애입니다8. PD는 손상된 미토콘드리아를 선택적으로 제거하는 세포 항상성을 유지하는 데 필요한 미토콘드리아 품질 관리 경로인 미토파지와 유전적으로 연결되어 있습니다 9,10. 연구에 따르면 FUN14 도메인 포함 1(FUNDC1) 매개 미토파지, Bcl-2 상호 작용 단백질 3(BNIP3) 촉진 미토파지, NIX 의존성 미토파지 및 잘 특성화된 PTEN 유도 키나아제 1(PINK1)/파킨 조절 미토파지10,11. PINK1(추정 키나아제)과 파킨(E3 유비퀴틴 리가아제)은 손상된 포스포-유비퀴티네이트 손상된 미토콘드리아와 함께 작용하여 손상된 세포 소기관을 삼키고 리소좀과 융합하여 분해를 시작하는 자가포식소체의 형성을 유도합니다 12,13,14,15,16. Parkin의 돌연변이는 도파민성 뉴런의 손실을 통한 신경변성과 같은 PD 관련 표현형과 관련이 있습니다17,18.
여기에서는 자궁경부암에서 유래한 불멸화 세포인 HeLa 세포를 사용하여 미토콘드리아 네트워크 건강을 유지하는 데 있어 Parkin의 역할을 조사하는 프로토콜이 설명되어 있습니다. HeLa 세포는 무시할 수 있는 수준의 내인성 파킨을 발현하므로 외인성 파킨 발현이 필요하다19. 미토콘드리아 네트워크 건강에서 파킨의 역할을 연구하기 위해 HeLa 세포를 야생형 파킨(ParkinWT), 파킨 돌연변이(ParkinT240R) 또는 빈 대조군 벡터로 형질감염시킵니다. ParkinT240R은 Parkin E3 ligase 활성에 영향을 미치는 상염색체 열성 소아 파킨슨증 돌연변이로, 미토파지 경로20의 효율성을 크게 감소시킵니다. HeLa 세포는 미토콘드리아 분리제인 카르보닐 시안화물 m-클로로페닐 히드라존(CCCP)의 경증(5μM) 또는 중증(20μM) 농도에 노출됩니다. 중증 농도의 CCCP를 이용한 치료는 다양한 세포주, 예컨대 HeLa 및 COS-7 세포에서 파킨 매개 미토파지를 유도하기 위해 일상적으로 사용된다21,22,23.
치료 후 이 프로토콜은 현재 사용 가능한 두 가지 미토콘드리아 표적 형광 염료를 사용하여 미토콘드리아 네트워크의 라이브 이미징을 사용합니다. 테트라메틸로다민, 에틸 에스테르, 과염소산염(TMRE)은 미토콘드리아 막 전위24를 기반으로 형광을 발하는 양이온성 염료이며, MitoSOX는 형광 강도가 과산화물 농도25의 함수인 미토콘드리아 과산화물 지표입니다. 마지막으로, 요약된 프로토콜은 형광 기반 정량화와 간단한 워크플로우를 사용하여 사용자 편향을 최소화하면서 미토콘드리아 막 전위와 과산화물 수준을 효과적으로 정량화합니다. 이 프로토콜은 HeLa 세포에서 미토콘드리아 기능을 연구하기 위해 설계되었지만 미토콘드리아 네트워크 건강을 정량적으로 특성화하기 위해 추가 세포주 및 일차 세포 유형에 적용할 수 있습니다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO, Anhydrous</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGENE 6 (Tranfection Reagent)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution)&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoSOX&#160; Red&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M36008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Deep Red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M7514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (Redued Serum media)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental models: Organisms/Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa-M (Homo sapiens)</td>
			<td>A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EYFP Empty Vector</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP-Parkin T240R</td>
			<td>This Paper</td>
			<td>Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP-Parkin WT</td>
			<td>Addgene; PMID:19029340</td>
			<td>RRID:Addgene_23955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Illustrator</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td>https://www.adobe.com/products/illustrator</td>
			<td>(Schindelin, 2012)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel (Spreadsheet Software)</td>
			<td>Microsoft Office&#160;</td>
			<td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite (LAS X)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft Office</td>
			<td>https://www.microsoft.com/excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism9 (Statistical Analysis Software)</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>https://www.graphpad.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage Incubator (Environmental Chamber)</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>https://www.oko-lab.com/cage-incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMiL Inverted Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIGHTNING Deconvolution Software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STELLARIS 8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-based quantification of mitochondrial membrane potential and superoxide levels using live imaging in hela cells

미토콘드리아는 ATP 합성을 통해 에너지 생산을 조절하여 대사 항상성에 중요한 동적 세포 기관입니다. 세포 대사를 지원하기 위해 다양한 미토콘드리아 품질 관리 메커니즘이 협력하여 건강한 미토콘드리아 네트워크를 유지합니다. 그러한 경로 중 하나는 손상된 미토콘드리아의 PTEN 유도 키나아제 1(PINK1) 및 파킨 포스포-유비퀴틴화가 리소좀 융합을 통해 세포에서 자가포식소 격리 및 후속 제거를 촉진하는 미토파지입니다. 유사분열은 세포 항상성에 중요하며 파킨의 돌연변이는 파킨슨병(PD)과 관련이 있습니다. 이러한 발견으로 인해 미토콘드리아 품질 관리의 분자 메커니즘과 역학을 이해하기 위해 미토콘드리아 손상 및 회전율을 조사하는 데 상당한 중점을 두었습니다. 여기에서 라이브 셀 이미징을 사용하여 HeLa 세포의 미토콘드리아 네트워크를 시각화하고 미토콘드리아 분리제인 카르보닐 시안화물 m-클로로페닐 히드라존(CCCP)으로 처리한 후 미토콘드리아 막 전위 및 슈퍼옥사이드 수준을 정량화했습니다. 또한, 파킨 의존성 미토파지를 억제하는 파킨의 PD 연관 돌연변이(ParkinT240R)를 발현하여 돌연변이 발현이 야생형 파킨을 발현하는 세포와 비교하여 미토콘드리아 네트워크에 어떤 영향을 미치는지 확인했습니다. 여기에 요약된 프로토콜은 미토콘드리아 막 전위와 과산화물 수준을 효과적으로 정량화하기 위해 형광 기반 접근 방식을 사용하는 간단한 워크플로를 설명합니다.

The mitochondrial network is a series of interconnected organelles that play a crucial role in energy production1, innate immunity2,3, and cell signalling4,5. Mitochondrial dysregulation has been associated with neurodegenerative diseases such as Parkinson&#39;s disease (PD)6,7. PD is a progressive neurodegenerative disorder affecting dopaminergic neurons of the substantia nigra that impacts nearly 10 million people worldwide8. PD has been genetically linked to mitophagy, a mitochondrial quality control pathway necessary for maintaining cellular homeostasis that selectively removes damaged mitochondria9,10. Studies have identified multiple independent mitophagy pathways, including FUN14 domain containing 1 (FUNDC1)-mediated mitophagy, Bcl-2 interacting protein 3 (BNIP3)-facilitated mitophagy, NIX-dependent mitophagy, and the well-characterized PTEN-induced kinase 1 (PINK1)/Parkin-regulated mitophagy10,11. PINK1 (a putative kinase) and Parkin (an E3 ubiquitin ligase) work in tandem to phospho-ubiquitinate damaged mitochondria, which drives the formation of autophagosomes that engulf the damaged organelle and fuse with lysosomes to initiate degradation12,13,14,15,16. Mutations in Parkin have been associated with PD-linked phenotypes such as neurodegeneration via the loss of dopaminergic neurons17,18.
Here, a protocol is described in which HeLa cells, routinely used immortalized cells derived from cervical cancer, are used to investigate the role of Parkin in maintaining mitochondrial network health. HeLa cells express negligible levels of endogenous Parkin and therefore require exogenous Parkin expression19. To study the role of Parkin in mitochondrial network health, HeLa cells are transfected with either wild-type Parkin (ParkinWT), a Parkin mutant (ParkinT240R), or an empty control vector. ParkinT240R is an autosomal recessive juvenile parkinsonism mutation that affects Parkin E3 ligase activity, significantly reducing the efficiency of the mitophagy pathway20. HeLa cells are subject to mild (5 &#181;M) or severe (20 &#181;M) concentrations of carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP), a mitochondrial uncoupling agent. Treatment with severe concentrations of CCCP is routinely used to induce Parkin-mediated mitophagy in various cell lines, such as HeLa and COS-7 cells21,22,23.
Following treatment, the protocol employs live imaging of the mitochondrial network using two currently available mitochondrial-targeted fluorescent dyes. Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate (TMRE) is a cationic dye that fluoresces based on mitochondrial membrane potential24, while MitoSOX is a mitochondrial superoxide indicator where the fluorescence intensity is a function of superoxide concentration25. Finally, the outlined protocol uses a fluorescence-based quantification and simple workflow to effectively quantify the mitochondrial membrane potential and superoxide levels with minimal scope for user bias. Although this protocol was designed to study mitochondrial function in HeLa cells, it can be adapted for additional cell lines and primary cell types to quantitively characterize mitochondrial network health.

저자 스포트라이트: HeLa 세포에서 실시간 이미징을 사용한 미토콘드리아 막 전위 및 과산화물 수준의 형광 기반 정량화  

HeLa 세포에서 라이브 이미징을 사용한 미토콘드리아 막 전위 및 슈퍼옥사이드 수준의 형광 기반 정량화

This research focuses on mitochondria dysregulation in neurodegenerative diseases. We believe that this research can be used to understand potential causes for disease onset that could lead to therapeutics combating neurodegenerative diseases like Parkinson's disease and ALS. Techniques such as super resolution microscopy like STED and SIM or expansion microscopy have improved the ability to accurately understand protein distribution within individual organelles and mitochondria distribution throughout the cell.Results of this technique can be used as a starting point to study the effect of Parkinson's disease linked mutations on mitochondrial turnover and begin to understand the importance of regulating reactive oxygen species levels and mitochondrial membrane potential to maintain neuronal health. Our laboratory aims to mechanistically characterize individual mitochondrial quality control pathways to understand the interplay between these pathways. By having insights into pathway dynamics, one can understand how mitochondria are maintained and how mitochondrial dysregulation contributes to neurodegenerative disease onset.

이 프로토콜에서는 CCCP 처리 후 미토콘드리아 네트워크의 막 전위와 과산화물 수준을 측정하기 위해 형광 기반 정량화를 사용했습니다(그림 1). 이 워크플로우는 자궁경부암에서 추출한 불멸화 세포주인 HeLa 세포를 사용했습니다. HeLa 세포는 미토콘드리아 생물학을 연구하는 데 일상적으로 사용되며 비교적 평평하여 현미경을 사용하여 미토콘드리아 네트워크를 쉽게 시각?...

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이 기술은 형광 기반 라이브 이미징을 사용하여 HeLa 세포 내의 미토콘드리아 막 전위와 과산화물 수준을 시각화하고 정량적으로 측정하는 효과적인 워크플로우를 설명합니다.

Mitochondria are dynamic organelles critical for metabolic homeostasis by controlling energy production via ATP synthesis. To support cellular metabolism, ...

이 연구는 신경퇴행성 질환의 미토콘드리아 조절 장애에 초점을 맞춥니다. 우리는 이 연구가 파킨슨병 및 ALS와 같은 신경퇴행성 질환을 퇴치하는 치료제로 이어질 수 있는 질병 발병의 잠재적 원인을 이해하는 데 사용될 수 있다고 믿습니다. STED 및 SIM과 같은 초고해상도 현미경 또는 확장 현미경과 같은 기술은 개별 세포 기관 내의 단백질 분포와 세포 전체의 미토콘드리아 분포를 정확하게 이해하는 능력을 향상시켰습니다.이 기술의 결과는 파킨슨병 관련 돌연변이가 미토콘드리아 회전율에 미치는 영향을 연구하고 신경 건강을 유지하기 위한 활성 산소 종 수준과 미토콘드리아 막 전위 조절의 중요성을 이해하기 시작하는 출발점으로 사용할 수 있습니다. 우리 실험실은 개별 미토콘드리아 품질 관리 경로를 기계적으로 특성화하여 이러한 경로 간의 상호 작용을 이해하는 것을 목표로 합니다. 경로 역학에 대한 통찰력을 가짐으로써 미토콘드리아가 어떻게 유지되고 미토콘드리아 조절 장애가 신경퇴행성 질환 발병에 어떻게 기여하는지 이해할 수 있습니다.

fluorescence-based-quantification-mitochondrial-membrane-potential

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells

3.1K 조회수.  Duke University Medical Center. 이 연구는 신경퇴행성 질환의 미토콘드리아 조절 장애에 초점을 맞춥니다. 우리는 이 연구가 파킨슨병 및 ALS와 같은 신경퇴행성 질환을 퇴치하는 치료제로 이어질 수 있는 질병 발병의 잠재적 원인을 이해하는 데 사용될 수 있다고 믿습니다. STED 및 SIM과 같은 초고해상도 현미경 또는 확장 현미경과 같은 기술은 개별 세포 기관 내의 단백질 분포와 세포 전체의 미토콘드리아 ...