我们感谢本科生助理在抚养这项工作期间的支持，特别是Regina Kurandina和Rhea Smykalski。Carolyn Kalinowski帮助汇编了有关其他鳞翅目金属毒性的文献。这项工作是由明尼苏达大学生态，进化和行为系暑期研究资助的。

这项研究是根据美国农业部APHIS许可证P526P-13-02979进行的。
1. 实验蝴蝶的收集
<ol><li>用空中防虫网捕捉成年雌性蝴蝶。卷心菜白通常存在于开放，受干扰的栖息地中，有花蜜植物和寄主植物（在芸苔科中）。<ol><li>当太阳出来并且温度温暖时搜索。为了瞄准雌性，寻找缓慢扑腾的个体，靠近地面，然后降落在植物上，用它们的前跗“鼓”（品尝）叶子。</li>
	</ol></li>
	<li>将雌性放在笼子里收获卵。 注意：田间收集的雌性平均与一两只雄配12，并且应该在捕获后不久开始产下受精卵。野生捕获的雌性需要自然光来产卵和交配，因此请将笼子放在温室或窗台上。</li>
	<li>用寄主植物饲养雌性以收获卵。 注意：雌性将接受各种寄主植物，包括绿甘蓝、萝卜、羽衣甘蓝、羽衣甘蓝和 拟南芥，但要确保植物没有经过任何杀虫剂处理。<ol><li>将寄主植物放在盆中或装有水的容器中以保持叶压，例如花水管中的羽衣甘蓝茎。</li>
		<li>如果研究人员希望收集卵并将它们直接转移到饮食中，首先使用橡皮筋将寄主植物叶子连接到塑料杯水的顶部，然后在边缘拉伸一块石蜡膜 - 雌性接触叶子会产卵到石蜡膜上（见5）。</li>
	</ol></li>
	<li>确保笼子里还含有一些东西来保持相对湿度高，例如，通过每天浇灌盆栽植物或弄湿毛巾，尤其是在干燥条件下。如果在笼子里浇水盆栽，请确保在花盆下面放一条毛巾，因为蝴蝶可能会卡在积水中。</li>
	<li>用黄色海绵上的 10% 稀释蜂蜜水溶液喂养蝴蝶，蝴蝶很快就会学会使用，特别是如果与有经验的人一起饲养。<ol><li>为了鼓励蝴蝶用海绵觅食，将它们直接放在喂食器上，尤其是在用水瓶轻轻喷洒后，这通常会导致它们伸出长鼻。</li>
		<li>要设置喂料器，首先彻底冲洗黄色或橙色海绵，然后将它们切成适合 60 毫米塑料培养皿的小方块。每天更换喂料器，在温和的漂白剂溶液中清洁海绵，然后彻底冲洗以防止霉菌生长。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 制作人工饮食
<ol><li>首先，使用 表1中的配方或其他相关来源来确定实验的相关配方。针对焦点物种或实验进行必要的修改。打印出在称量成分时要遵循的配方。</li>
	<li>将除琼脂以外的所有干成分称重到一个容器中。确保将成分放回各自的储存位置，注意几种成分储存在 4° C.将预先称重的干燥成分混合物放入装有 5 mL 亚麻籽油的搅拌机中。</li>
	<li>对于每个饮食批次，请按照下面详述的步骤进行操作。<ol><li>将 15 g 细网状琼脂与 400 mL 蒸馏水混合在至少 1 L 大小的烧杯中。微波直到琼脂接近沸腾，整个混合物中都有细小的气泡，每30-60秒搅拌一次混合物以防止沸腾。</li>
		<li>在这种热琼脂混合物中，加入 400 mL 水龙头温度蒸馏水，使其达到适当的温度以与干成分混合，因为维生素混合物对热敏感。</li>
		<li>将琼脂混合物加入搅拌机中并充分混合，必要时刮擦搅拌机的边缘。</li>
	</ol></li>
	<li>当琼脂加热时，将至少七十四盎司的减肥杯放在柜台上，边缘接触。彻底混合饮食后，将搅拌机中的混合物倒入减肥杯中，确保饮食覆盖每个杯子的底部。</li>
	<li>饮食冷却后，盖上杯子，用饮食类型标记减肥杯，将它们堆叠在托盘上，并在4°C下储存长达1个月直至使用。</li>
</ol>3. 人工日粮的转移和饲养
<ol><li>在24°C气候室中，将带有蝴蝶卵的寄主植物叶子放在30盎司熟食杯中，并带有网盖。1周后，检查杯子 - 确保幼虫孵化，并且在第一龄后期或第二龄早期，这是转移到人工饮食的好时机。</li>
	<li>用画笔将幼虫转移到人工饮食中，用漂白剂喷雾消毒，并在幼虫容器之间冲洗水。将三只幼虫转移到每个 4 盎司的杯子中。虽然人工饮食能量密集，可以支持高密度的幼虫，但避免将幼虫装入杯子中，因为疾病和霉菌可以在幼虫密度高的杯子中传播。</li>
	<li>将杯子放入侧面的塑料箱中，使碎屑落到杯子底部并远离饮食，从而降低霉菌和疾病风险。<ol><li>将减肥杯放在低至中等光照水平的受控温度条件下。通过透过透明的杯盖，每 1-2 天监测杯子的霉菌和疾病。</li>
		<li>有霉菌或疾病的杯子可以隔离或冷冻，以防止传播到其他杯子。</li>
	</ol></li>
</ol>4.成虫的出现和处理
<ol><li>让幼虫化蛹并在饮食杯中出现。当成虫出现时，给它们几个小时让翅膀变硬，然后再将它们移开做标记。用干净的手轻轻抓住成年蝴蝶的翅膀，从杯子里取出它们，注意抓住所有四个翅膀更靠近它们的身体是一种更稳定的握持。</li>
	<li>要标记蝴蝶，请抓住干燥的个体的头部和胸部，并使用细尖尖的尖头在它们的后翅上轻轻标记一个数字。<ol><li>使用翅膀标记和生殖器组合的性别个体;雌性通常在前翅背侧有两个黑色斑点，后翅较暗、更黄，而雄性通常在较亮的白色背景上的背侧前翅上有一个较小的黑点54。</li>
		<li>鉴于这种颜色显示出个体和季节变化，请使用腹部特征确认性别 - 男性在腹部远端有两个扣环，腹部通常较窄，而女性只有一个生殖器开口。</li>
	</ol></li>
	<li>将成虫转移到蜡玻璃信封上，用一只手打开信封，抓住蝴蝶的头部和胸部，将其滑入信封中，另一只手抓住翅膀穿过信封。<ol><li>确保所有四个机翼在信封内正常关闭。</li>
		<li>在实验前将蝴蝶在寒冷条件（5-6°C）下保持长达1周，但从冰箱中取出时至少要适应1天。</li>
	</ol></li>
</ol>5. 绩效措施
<ol><li>要测量死者的翅膀特征，请用一只手握住胸部并使用镊子去除其底部的每个翅膀来移除蝴蝶的翅膀。将机翼平放在灯箱中并拍照以供以后测量。</li>
	<li>为了估计繁殖力，将成虫安置在交配笼中，至少允许雄性生殖成熟 1 天和交配 1 天。在设定的时间点通过解剖处死雌性以进行卵计数，或每天在寄主植物上收集卵。</li>
	<li>要估计卵子负荷，请取出雌性的腹部，将其放入 1x PBS 缓冲液中，然后沿腹侧切一条缝。<ol><li>用镊子将内脏与角质层分开，然后将卵巢从肠道、气管和腹部的其他内容物中拉开。</li>
		<li>在两个卵巢中的每一个内展开四个卷曲的卵巢，注意成熟、蛋黄和带壳的卵子过渡到未成熟卵泡的位置。使用计数器帮助统计成熟卵子总数，通常范围为 0-200 个卵子。</li>
	</ol></li>
	<li>要确定解剖雌性的交配状态，请打开滑囊并分离其中的精子细胞。当精子细胞被消化时，它们通常会形成一条“尾巴”并相互嵌套。</li>
</ol>6. 案例研究
注意：2014年从野外收集成年雌性卷心菜白蝴蝶，以建立实验种群。成年雌性起源于加利福尼亚州戴维斯附近（N = 8 名创始雌性）。
<ol><li>容纳蝴蝶<ol><li>将雌性安置在“BugDorm”网笼（61 cm x 61 cm x 61 cm）中，自然光照射在温室中。提供寄主植物卷心菜（芸苔属油菜）的有机叶子用于产卵。</li>
		<li>为了保持笼子里的湿度，包括一个每天浇水的小盆栽植物（Cosmos），放在每个笼子里的毛巾上。</li>
		<li>每天通过将装有新鸡蛋的叶子转移到盖子上有孔的 473 mL 塑料杯中并放入气候室来收集鸡蛋。</li>
		<li>随意为蝴蝶提供 10% 的蜂蜜水溶液（通过用蒸馏水稀释有机蜂蜜制成），可通过每天更换的小培养皿中的黄色海绵进入。</li>
	</ol></li>
	<li>准备人工饮食<ol><li>使用先前开发的鳞翅目饮食的修改为卷心菜白幼虫准备人工饲料4.一批日粮含有小麦胚芽50克，酪蛋白27克，纤维素10克，蔗糖24克，卷心菜粉15克，威森盐混合物9克，托鲁拉酵母12克，胆固醇3.6克，范德赞特维生素混合物10.5克，对羟基苯甲酸甲酯1.1克，山梨酸1.5克， 3克抗坏血酸和0.175克链霉素（见 材料表）。</li>
		<li>预先称量多个日粮批次的干成分（表1）并充分混合以增加不同日粮类型的均匀性，然后再细分为单独的批次与金属溶液混合。</li>
		<li>将干成分放入装有亚麻籽油和相应金属混合物的搅拌机中。 注意：本实验中使用了亚麻籽油，因为它是由过去的昆虫饲料供应商出售的。现在，有机亚麻籽油被专门使用，它由同一植物制成，但不太可能像亚麻籽油的商业供应商那样含有任何添加剂。</li>
		<li>将准备好的饮食倒入 118 毫升（4 盎司）塑料熟食杯中。使用可溶性金属盐在人工饮食中添加焦点金属。根据先前对植物金属含量的观察（例如，镍积累55,56,57或植物的路边污染58,59,60）和其他鳞翅目49,50,51中的金属耐受性，瞄准金属浓度。</li>
		<li>将金属盐溶解在 500-1,000 mL 蒸馏水中，然后服用相应量添加到人工日粮中。例如，要制作 100 ppm 镍日粮，请在混合前向人工日粮中加入 317.6 mL 的 1 M NiCl2 溶液，得到最终日粮浓度为 100 mg/g Ni 干重（约 53 mg/g 湿重）。该量转化为基于电感耦合等离子体原子发射光谱的平均测量浓度为109.6 ppm（表2）。 注意：金属水平由明尼苏达大学的研究分析实验室用六个样本估计。</li>
	</ol></li>
	<li>保养<ol><li>将寄主植物上收获的卵保持在气候室中，在23°C的14：10光周期上保持7天。在此之后，将早期的第二龄幼虫转移到人工饮食中。</li>
		<li>在转移时，将给定植物的幼虫均匀地分配到四种饮食类型中，以避免将幼虫批次与饮食类型混淆。每 118 mL 饮食杯将幼虫（N = 346 总数）转移为两个个体，以减少过度拥挤造成的疾病发生率，并为成虫最终封闭留出充足的空间。</li>
		<li>在饲养杯的盖子上打孔（每个盖子三个）。将杯子放在鞋盒大小的塑料箱中进行饲养，穿插不同的日粮，以避免在饲养室中的位置产生任何系统性影响。</li>
		<li>在14：10光周期的23°C气候室中容纳幼虫杯（在室底部有水箱以保持湿度在50%-60%左右，用家用湿度传感器监测）。如果杯子发霉（在本案例研究中总共大约八个杯子），请从腔室中取出杯子并从实验中取出这些人。</li>
		<li>让幼虫化蛹并在饲养杯中出现（N = 162 总数）。 注意：对于本研究中的饲养条件，从收集卵子到成虫出苗的发育时间平均约为25-30天（范围为20-40天，例如，25,28）。</li>
		<li>当蛹接近成虫时，每天检查杯子中是否有新闭合的个体，并取出翅膀干燥的成虫。使用细尖黑色尖刀在后翅上标记成虫，并用其相应的个体编号（在幼虫转移时分配）。确定每个人的性别，并在玻璃信封上标记他们的编号和出现日期。将成年蝴蝶放入玻璃信封中，储存在-20°C直至进一步加工。 注意：一小部分新兴成虫表现出会干扰飞行和成虫生存的翅膀畸形（5%-8%）;这些个体被排除在这些实验的生存分析之外。</li>
	</ol></li>
	<li>测量和数据分析<ol><li>测量生存率，从第二龄（当毛毛虫被置于饮食中时）到成年出现的生存率。 注意：本研究的重点是生存和发育时间，作为不同饮食表现的衡量标准。</li>
		<li>将发育时间测量为转移到饮食和成虫在气候室中出现之间的天数。</li>
		<li>对于数据分析，运行两组模型，其中包括金属和浓度之间的相互作用。 注意：由于两种相互作用都是显着的（F 2,194 = 4.56，p = 0.01表示开发时间，X2 = 12.1，p = 0.002表示存活），因此研究对每种金属进行了单独的分析。</li>
		<li>为了分析生存率，对每种金属进行卡方检验，以测试金属剂量（被视为四类）对翅膀完全完整的成年生存的影响。</li>
		<li>当检测到剂量的显着影响时，进行随访卡方以将每个水平与对照饮食进行比较。分析发育时间（从转移到成年出现），测试性别对发育时间的影响。 注意：由于性别对显影时间没有影响，（p > 0.10）对于本实验中的任何金属，我们在模型中将其从考虑范围中删除。</li>
		<li>对每种金属运行单独的方差分析，以测试四种浓度对显影时间的影响。此外，针对相对于对照的每个浓度运行 t 检验，以确定看到性能效应的最小浓度。 注：在本研究中，JMP v16用于所有分析。所有原始数据均可在Mendeley61上找到。</li>
	</ol></li>
</ol>

白蝴蝶的人工饲养和重金属耐受性

作者没有利益冲突需要声明。

在这项研究中，卷心菜白蝴蝶（Pieris rapae）在人工饮食中饲养，以检查重金属毒性的差异。在此过程中，本研究为这种易于操作的蝴蝶系统的饲养和实验室研究提供了一般方法。本次讨论首先考虑了有关此处所审查的方法的更一般的问题，然后回顾了我们的科学发现，然后对人工饮食的组成部分进行了反思。
这里回顾的协议给出了卷心菜白蝴蝶的一般饲养方法的步骤，但该协议中有许多要点可以调整。例如，虽然这里介绍的案例研究使用海绵进行喂养，但其他研究人员很幸运地使用牙芯和装满蜂蜜水的绢花5。虽然本研究使用蜂蜜水作为食物，但其他研究人员使用了糖溶液甚至佳得乐。如果需要称量蛹，或移动到其他条件以出苗（例如，诱导滞育和需要冷藏1个月），研究人员可以轻松地将它们从杯子中取出，方法是用水喷洒以润湿它们的丝绸附件并用羽毛钳抓住它们，然后使用双面胶带重新悬挂它们。如果研究人员在成年蝴蝶何时被移入笼子以进行成年行为方面需要更大的灵活性，它们可以在冰箱中放置数周，但需要喂食。每隔几天，应将蝴蝶取出喂入稀释的蜂蜜水溶液。在室内照明下，这可以通过使用别针将它们的长鼻展开到食物中来完成。在成人表演端，可以对卷心菜白蝴蝶采取广泛的健身措施。体型可以测量为幼虫在某些阶段、蛹或成虫（处死或保存在玻璃信封中）的湿质量或干质量，或通过在程序 ImageJ 中测量翅膀长度（见 12,24,25,28）。雌性的终生繁殖力可以通过寄主植物25,69,70的每日取卵来衡量，特定性状的大小可以作为性能的指标来衡量;例如，大脑或单个大脑区域的质量或体积62,71,72，或胸部或飞行肌肉的质量或蛋白质含量62,70。最后，成年人可用于行为研究，以测试任意数量的问题，以检查饮食操纵对觅食或产卵选择的影响27,73。
如果饲养协议未按预期工作，则有几个方面需要排除故障。首先，人们可以问光线水平是否足够高，以引发正常的成人行为。虽然实验室适应的Pieris系列将在荧光灯下产卵，但唯一适用于野生型系的人造光是强大的广谱温室灯。温室、窗台或户外的自然光最能引发交配和产卵行为。其次，如果卵没有孵化，或者幼虫在发育早期死亡，需要考虑一些事情。寄主植物材料必须是有机的，请注意，商店中的“有机”植物有时会用可以杀死幼虫的化学物质进行处理，因此饲养自己的寄主植物通常是最好的。如果宿主接受率较低，则可以尝试氮含量较高的年轻叶子，呈现盆栽植物而不是单个叶子，并确保雌配。雌性将接受播种芸苔属植物，即使是 2 周龄的小芽。石蜡法可以很好地将鸡蛋转移到不同的条件下，但应该注意的是，接受率往往低于整株植物。第三，饮食的所有成分必须是高质量的，没有过期。亚麻籽油应每年更换并存放在冰箱24,25中。小麦胚芽、维生素混合物和抗生素也应保持凉爽。第四，可以考虑调整减肥杯的设置。可以使用任意数量的一次性塑料杯类型进行饲养，从 1 盎司到 15 盎司不等。我们发现 4 盎司的尺寸很好，可以容纳成虫出现，并且可以很好地装入我们的气候室。盖子上戳的孔允许气流，但在低湿度条件下，太多的孔会使饮食干燥，因此可能需要调整此数字。第五，气候室中的条件可能需要结合杯子条件进行调整。如果条件太干燥，有卵的寄主植物可能会在幼虫转移之前变干，而有饮食的杯子可能会在蝴蝶出现之前变干。另一方面，如果条件太湿，杯子可能会发霉和生病。研究人员可能需要通过使用网状盖子或盖子上或多或少的孔来调节杯子中的气流。另一个常见问题是腔室灯足够亮，会导致杯子温度波动和冷凝积聚;使用调光灯是幼虫饲养的简单选择。
关于本文的研究问题，本研究发现卷心菜白对铜的敏感度高于镍或锌。铜对浓度低至50 ppm（图3和表3）的开发时间和500 ppm时的存活率（图4，表4）有显著的负面影响。相比之下，镍对生存没有负面影响（高达500 ppm;图3）或在 100 ppm 时对显影时间产生负面影响（图 4）。卷心菜白对锌的耐受性相当强，仅在 1,000 ppm 时观察到生存效果（图 3），从 100 ppm 开始对开发时间产生负面影响（图 4）。基于蝴蝶组织和芥末（它们的寄主植物;图1），预计对锌的耐受性相对较高。然而，鉴于蝴蝶组织中镍的含量非常低（图1）以及铜作为微量营养素的必要性，对铜的敏感性和对镍的耐受性有些出乎意料。在考虑了这些金属在其他蝴蝶和飞蛾中的耐受性后，下面将讨论这些意想不到的发现。
为了将现有数据与其他鳞翅目中测量的金属敏感性进行比较，汇编了现有研究的数据，其中重金属对生存产生负面影响 49,50,51,56,63,64,65,66,67,68;这些研究的重点是飞蛾，特别是害虫物种（Galleria mellonella，Lymantria dispar，Plutella xylostella，Spodoptera sp.）。本研究中所有测量的灵敏度值都接近这些其他物种的测量范围（图5）。然而，这项研究中镍耐受性的测量值似乎确实高于预期 - 虽然在500 ppm下没有显着的生存影响，但之前对Pieris rapae的研究也发现对镍的耐受性非常高（显着影响从1,000 ppm56开始），尽管它们组织中的自然水平较低（图1).这项研究中铜敏感性的测量似乎也处于鳞翅目研究的低端。虽然使用人工饮食可以方便和受控地比较相对金属灵敏度，但重要的是要注意，饮食的成分可能会改变绝对金属灵敏度的测量。例如，饮食中的维生素C可以抵消金属诱导的氧化应激74，或者饮食中的抗生素可以改变微生物对金属加工的任何影响75。未来一个有趣的研究方向是系统地操纵这些饮食成分来测试对金属毒性的影响，特别是考虑到关于鳞翅目肠道微生物76,77和可能具有抗氧化特性的花蜜成分的功能作用的问题78。此外，不同物种饮食需求的差异可能使种间比较具有挑战性，基于人工饮食的方法应辅以对寄主植物的操纵。
这些蝴蝶对镍特别耐受，对铜敏感。先前的研究已经注意到，芥菜科中的许多植物，包括受Pieridae青睐的植物，过度积累镍作为对食草动物55,56,63,79,80,81的防御机制。这种超积累在植物组织中超过1,000 ppm，比大多数植物中所看到的要大几个数量级（图1）。正如之前推测的那样，由于过去选择的此类镍蓄能器，Pieris可能对镍具有特别高的耐受性26。虽然铜作为昆虫饮食中的微量营养素研究较少，但有一些证据表明它在繁殖和免疫中起的作用很小，尽管主要在吸血昆虫中（例如，82,83）。铜在蝴蝶中的生理作用可能不如其他动物重要84,85,86，这与最近的工作一致，强调铜如何与铅，镉和汞等昆虫污染物有关（例如，87,88,89）。虽然Pieris已被证明可以避免低水平90的铜污染，但铜在植物中的流动性（例如，移动到叶子和花朵中）也将其标记为值得关注的金属污染物91。
虽然这些结果提供了有关这些金属对卷心菜白蝴蝶相对毒性的有趣数据，但本文还旨在作为饲养这种强大系统的方法的详细视觉说明。卷心菜白易于饲养和操纵在受控实验室实验4,5中有助于宿主搜索6,7,8，觅食9,10,11和性选择12,13,14的研究。以人工饮食饲养这些蝴蝶的能力是创造共同花园条件进行比较和操纵营养物质、毒素甚至新型寄主植物的关键。然而，重要的是要注意，这种人工饮食不一定是该物种的最佳人工饮食，并且可能会通过未来的操作得到改善。例如，这种饮食（和其他鳞翅目动物饮食）中的盐混合物最初是为脊椎动物开发的，其钙含量高于大多数昆虫所需的钙水平92,93。因此，我们的一些饲养工作已经制作了钙含量较低的定制盐混合物（例如，62），而另一些则使用“贝克盐混合物”，这可能更适合许多昆虫物种94。在我们自己的操作中，我们还发现，与原始浓度相比，蝴蝶在相对较少的小麦胚芽和相对更多的纤维素下表现更好4。需要进一步关注的一个领域是饮食中的脂质来源和浓度。例如，过去的研究表明，从亚麻籽油（用于本研究）转向磷脂会增加人工日粮中Pieris的交配率和生长速率95。在人工饮食中补充特定脂肪酸可能会产生额外的积极影响96,97。优化Pieris98,99的人工饮食为解决有关营养生态学100,101,102，进化生态学和生态毒理学的有趣问题创造了机会。这些人工饮食方法使研究人员能够解决有关特定脂质在认知进化103，毒素预适应28，降低污染物毒性的饮食成分104或营养素之间的化学计量相互作用105中的作用的问题。

小卷心菜白蝴蝶（Pieris rapae，以下简称“白菜”）是芥菜作物的一种世界性害虫，如卷心菜、西兰花和油菜 1,2,3。同时，卷心菜白是生物学研究的强大系统，也是常用的蝴蝶模型，因为它们可以在受控实验室实验中轻松饲养和操纵4,5。对白菜白蝴蝶的研究为宿主搜索6,7,8，花蜜资源利用9,10,11，配偶选择和性选择12,13,14，翅膀模式发育和进化15,16,17以及对新颖和变化的反应提供了重要的见解。环境18,19.其中许多见解依赖于这样一个事实，即卷心菜白可以通过人工饮食4,20,21饲养，这可以精确地操纵以反映不良的营养条件22,23，生态相关的污染物水平24,25,26,27，或向新型寄主植物的过渡28,29.本研究使用重金属暴露实验来说明在实验室中人工饮食饲养卷心菜白蝴蝶的基本方法以及幼虫和成虫的关键性能指标。这些方法的许多方面适用于可以通过人工饲料饲养的其他蝴蝶30,31和飞蛾32,33,34。
本文通过金属耐受性实验来说明白菜白蝴蝶的饲养方法。重金属是一种常见的人为污染物，源于人类产品、工业过程的降解以及历史上在杀虫剂、油漆和其他产品中使用的遗留污染35,36,37,38。许多重金属，包括铅、铜、锌和镍，可以从土壤和水中移动到植物组织中39,40,41,42，灰尘中的金属可以沉积在植物叶子上43,44,45，导致多种途径暴露于植物噬虫幼虫。生命早期的重金属暴露会对动物发育产生负面影响，尤其是对神经组织，高水平可致死35,36,46,47,48。许多研究表明，金属暴露对发育中的昆虫（包括害虫和益虫）的负面影响49,50,51。大量的重金属污染物，以及它们经常在人类环境中同时发生的事实52，意味着需要精确的实验室方法，研究人员可以将发育中的昆虫暴露于不同水平和不同金属的组合中，以了解和减轻其对环境的影响。
本工作对比了常见金属对卷心菜白生存和发育的影响，重点关注铜（Cu），锌（Zn）和镍（Ni），这是人类环境中的三种常见污染物。例如，来自明尼苏达州农村路边的杂草含有高达 71 ppm 的锌、28 ppm 的铜和 5 ppm 的镍53。该实验操纵卷心菜白蝴蝶人工饮食中这些金属的含量，其水平与环境中看到的水平相对应并超过。人工饮食用于对比这些金属的相对毒性，预测卷心菜白对金属污染物更敏感，这些金属污染物不是其生理学（镍）的组成部分，相对于酶和组织（铜和锌; 图1）。自始至终，本文提供了方法细节和随附的视频可视化，以说明这一重要蝴蝶模型系统的饲养和研究方法。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-L Pyrex beaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-250-059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL graduated cylinder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-007-43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60-mm plastic petri dish lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Frontier</td>
			<td>6015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blender</td>
			<td>Amazon - Ninja Store</td>
			<td>BL610 Professional</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabbage Flour</td>
			<td>Frontier</td>
			<td>1086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Frontier</td>
			<td>1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celluose</td>
			<td>Frontier</td>
			<td>3425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholsterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cups for rearing (4 oz)</td>
			<td>Wasserstrom</td>
			<td>6094583</td>
			<td>purchase with matching lids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Mesh Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaxseed Oil</td>
			<td>amazon</td>
			<td>B004R63VI6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floral water tubes, 2.8 x 0.8inch</td>
			<td>Amazon - Yimaa Direct</td>
			<td>B08BZ969DK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassine envelopes (1 3/4 x 2 7/8 INCHES)</td>
			<td>Amazon - Wizard Coin Supply</td>
			<td>B0045FG90G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh Cages (15.7 x 15.7 x 23.6&#34;)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07SK6P94S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl Paraben</td>
			<td>Frontier</td>
			<td>7685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ohaus Portable Scale</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-112-228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organic Honey</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07DHQQFGM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo studio portable lightbox</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07T6TNYJ1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic bin, shoebox size</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B09L3B3V1R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic disposable transfer pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-680-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatulas</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-357Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Target</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Torula Yeast</td>
			<td>Frontier</td>
			<td>1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanderzant vitamin mix</td>
			<td>Frontier</td>
			<td>F8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh boats</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-549-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wesson Salt Mix</td>
			<td>Frontier</td>
			<td>F8680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ</td>
			<td>Frontier</td>
			<td>G1659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden handled butterfly net, 12&#34; hoop</td>
			<td>Amazon - Educational Science</td>
			<td>B00O5JDLVC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yellow sponges</td>
			<td>Amazon-Celox</td>
			<td>B0B8HTHY5B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rearing the cabbage white butterfly (pieris rapae) in controlled conditions: a case study with heavy metal tolerance

白菜白蝴蝶（Pieris rapae）是应用害虫防治研究和行为与营养生态学基础研究的重要系统。卷心菜白可以很容易地在受控条件下人工饲养，使它们成为蝴蝶世界的模式生物。在本文中，使用重金属暴露的操纵来说明饲养该物种的基本方法。一般方案说明了如何在田间捕获蝴蝶，诱导蝴蝶在温室笼子中产卵，并作为幼虫转移到人工饲料中。这些方法展示了如何标记、测量和研究蝴蝶的各种研究问题。代表性结果给出了如何使用成分不同的人工日粮来评估相对于对照日粮的蝴蝶性能的想法。更具体地说，蝴蝶对镍的耐受性最高，对铜的耐受性最差，锌的耐受性介于两者之间。讨论了这些结果的可能解释，包括一些芥末寄主植物中的镍过度积累，以及昆虫中最近的证据表明铜可能比以前认识到的毒性更大。最后，讨论首先回顾了协议的变化和对这些方法进行故障排除的方向，然后考虑未来的研究如何进一步优化本研究中使用的人工饮食。总体而言，通过提供人工饮食中卷心菜白的饲养和测量的详细视频概述，该协议为在广泛的研究中使用该系统提供了资源。

The small cabbage white butterfly (Pieris rapae, hereafter &#34;cabbage white&#34;) is a cosmopolitan pest species of mustard crops, such as cabbage, broccoli, and canola1,2,3. At the same time, the cabbage white is a powerful system for research in biology and a commonly used butterfly model, as they can be easily reared and manipulated in controlled lab experiments4,5. Research on cabbage white butterflies has provided critical insights with respect to host searching6,7,8, nectar resource use9,10,11, mate choice and sexual selection12,13,14, wing pattern development and evolution15,16,17, and responses to novel and changing environments18,19. Many of these insights rely on the fact that cabbage whites can be reared on artificial diets4,20,21, which can be precisely manipulated to reflect poor nutritional conditions22,23, ecologically relevant pollutant levels24,25,26,27, or transitions to novel host plants28,29. The present study uses an experiment on exposure to heavy metals to illustrate basic methods for rearing cabbage white butterflies on an artificial diet in the laboratory and key performance measures of larvae and adults. Many aspects of these methods apply to other butterflies30,31 and moths32,33,34 that can be reared on an artificial diet.
In this paper, an experiment on metal tolerance is used to illustrate the general methods of rearing cabbage white butterflies. Heavy metals are a common anthropogenic pollutant stemming from the degradation of human products, industrial processes, and legacy contamination from historical use in pesticides, paints, and other products35,36,37,38. Many heavy metals, including lead, copper, zinc, and nickel, can move from soil and water into plant tissue39,40,41,42, and metals in dust can be deposited on plant leaves43,44,45, resulting in multiple routes of exposure to phytophagous insect larvae. Heavy metal exposure early in life can have negative effects on animal development, especially on neural tissue, and high levels can be lethal35,36,46,47,48. A number of studies have shown the negative effects of metal exposure on developing insects, including both pests and beneficial insects49,50,51. The large number of heavy metal pollutants, and the fact that they often co-occur in human environments52, means that precise lab methods are needed in which researchers can expose developing insects to different levels and combinations of diverse metals to understand and mitigate their environmental effects.
The present work contrasts the impacts of common metals on cabbage white survival and development, focusing on copper (Cu), zinc (Zn), and nickel (Ni), three common pollutants in human environments. For instance, forbs from rural Minnesota roadsides contain up to 71 ppm Zn, 28 ppm Cu, and 5 ppm Ni53. This experiment manipulates the levels of these metals in artificial diets of cabbage white butterflies at levels corresponding to, and exceeding, the levels seen in the environment. An artificial diet is used to contrast the relative toxicity of these metals, predicting that cabbage whites would be more sensitive to metal pollutants that are not an integral part of their physiology (nickel) relative to those that occur, albeit at small levels, in enzymes and tissue (copper and zinc; Figure 1). Throughout, this text provides methodological details and accompanying video visualizations to illustrate the rearing and research methods of this important butterfly model system.

作者聚焦：调查卷心菜蝴蝶对城市污染物的耐受性 

在受控条件下饲养卷心菜白蝴蝶（Pieris rapae）：具有重金属耐受性的案例研究

概述 人工饮食可用于在标准条件下饲养卷心菜白蝴蝶，以测试某些饮食成分对蝴蝶性能的影响。在本工作中，使用人工饲料来研究在污染地区生长的寄主植物中发现的不同金属的毒性（图1）。幼虫是在含有三种不同金属浓度增加的日粮中饲养的（图2;具体方法学细节见议定书第6节）。蝴蝶的生存和发育受铜和锌的影响更大，受镍的影响最小（图3和图4），其敏感性与其他人工饲料饲养的蝴蝶和飞蛾的研究相当（图5）。
生存 将蝴蝶幼虫转移到含有铜，镍，锌或对照的人工饲料中，其中每种金属类型的浓度在三个水平上不同（表3）。增加毒素剂量的幼虫的代表性图像如图2所示。金属浓度对镍的存活率没有影响，但对铜和锌都有显著影响（表3和图3）。事后卡方比较表明，仅在锌含量最高（1,000 ppm，事后比较 X12 = 8.41，p = 0.004; 图1）。铜也仅在使用的最高水平（500 ppm，X12 = 7.00，p = 0.008）下显示出显着的 生存率下降，尽管在两个最低水平（50 ppm和100 ppm;图3）。
开发时间 铜和锌浓度对显影时间有显著影响（表 4和 图4）。随着铜浓度的增加，显影时间增加，从50 ppm开始与对照有明显偏差（p = 0.027; 图3）。随着锌浓度的增加，显影时间增加，从100ppm开始与对照有显着偏差（p = 0.03; 图4）。镍有增加导致更长开发时间的趋势（p = 0.08; 表4），每种饮食与对照组的比较显示，从100ppm开始有显著效果（p = 0.022; 图4）。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65383/65383fig01.jpg"> 图1：蝴蝶组织和寄主植物中观察到的焦点金属水平 。 （数据来自62。显示了Pieris蝴蝶组织（在实验室中用大白菜饲养）和野生收集的芥末（Bertorea sp.）的铜，镍和锌水平。汽车指示在交通繁忙的道路上看到的植物叶子的水平53.本研究中使用的人造日粮中的金属含量报告在 表1中;点表示均值，误差线表示标准误差。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65383/65383fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65383/65383fig02.jpg"> 图2：同一天转移到毒素浓度增加的人工饲料中的卷心菜白色幼虫的图像。 该图像显示了来自剂量反应研究的幼虫（在 28 中使用干燥的植物材料用于有毒植物马兜铃）。照片由ESR提供。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65383/65383fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65383/65383fig03.jpg"> 图3：浓度增加的金属日粮的生存率变化。 星号表示相对于对照饮食的生存率有显著偏差。日粮中的确切金属浓度列于 表2中。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65383/65383fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65383/65383fig04.jpg"> 图4：金属浓度对显影时间的影响。 星号表示相对于对照有显著差异的最低金属浓度（使用 t 检验）。日粮中的确切金属浓度列于 表2中。点表示均值，误差线表示标准误差。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65383/65383fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65383/65383fig05.jpg"> 图5：其他鳞翅目昆虫的金属耐受性摘要。显示的是来自11项现有研究49,50,51,56,63,64,65,66,67,68的综合生存数据。响应变量是首次看到对生存的负面影响的金属浓度水平（以 ppm 为单位）。蝴蝶表示这项研究的结果，并指出镍的公差值高于本研究中测量的值。点表示均值，误差线表示标准误差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65383/65383fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>成分</td>
			<td>称量为</td>
			<td>g</td>
			<td>毫升</td>
		</tr><tr><td>小麦胚芽</td>
			<td>干配料</td>
			<td>50</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>纤维素</td>
			<td>干配料</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>卷心菜粉</td>
			<td>干配料</td>
			<td>15</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>酪蛋白</td>
			<td>干配料</td>
			<td>27</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>蔗糖</td>
			<td>干配料</td>
			<td>24</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>威森盐混合物</td>
			<td>干配料</td>
			<td>9</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>托鲁拉酵母</td>
			<td>干配料</td>
			<td>12</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>胆固醇</td>
			<td>干配料</td>
			<td>3.6</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>维生素混合物</td>
			<td>干配料</td>
			<td>10.5</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>对羟基苯甲酸甲酯</td>
			<td>干配料</td>
			<td>0.75</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>山梨酸</td>
			<td>干配料</td>
			<td>1.5</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>抗坏血酸</td>
			<td>干配料</td>
			<td>3</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>链霉素</td>
			<td>干配料</td>
			<td>0.175</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>亚麻籽油</td>
			<td>湿配料</td>
			<td></td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>琼脂</td>
			<td>琼脂</td>
			<td>15</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>表1：人工饮食的配方。 图中所示为一批白菜白蝴蝶饮食中成分的重量（和体积）。干燥成分（和亚麻籽油）与琼脂混合物分开制备（溶解在400mL沸水中，然后用400mL室温水降至较低温度）。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>饮食类型</td>
			<td>铜 （千米）</td>
			<td>镍 （千分之一）</td>
			<td>锌 （千米）</td>
		</tr><tr><td>铜-“100 ppm”</td>
			<td>96.1</td>
			<td>1.75</td>
			<td>69.9</td>
		</tr><tr><td>镍-“100 ppm”</td>
			<td>7.29</td>
			<td>109.6</td>
			<td>68.9</td>
		</tr><tr><td>锌-“100 ppm”</td>
			<td>7.96</td>
			<td>1.06</td>
			<td>186.2</td>
		</tr><tr><td>锌-“500 ppm”</td>
			<td>6.51</td>
			<td>1.16</td>
			<td>708</td>
		</tr><tr><td>控制</td>
			<td>5.89</td>
			<td>0.59</td>
			<td>59.3</td>
		</tr></tbody></table>表2：饮食中金属的测量。 图中显示了研究中使用的人工饮食子集中铜、镍和锌的平均水平。饮食名称（分析中的“类型”）显示在左侧，引号中的值是计算的水平。目标浓度用引号引起来。分析了研究中使用的饮食子集，以确保计算值与实现值一致;应该注意的是，饮食成分的组成通常存在一些小程度的变化，并且报告的每条线仅代表一个重复。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>我t al</td>
			<td>培生 X32</td>
			<td>P</td>
		</tr><tr><td>铜 （N = 118）</td>
			<td>17.82</td>
			<td>0.0005</td>
		</tr><tr><td>镍 （N = 152）</td>
			<td>3.45</td>
			<td>0.33</td>
		</tr><tr><td>锌 （N = 152）</td>
			<td>12.52</td>
			<td>0.006</td>
		</tr></tbody></table>表3：金属浓度对存活率的影响。 图中显示了每种金属的卡方测试结果，对比了相对于对照饮食的三种金属浓度。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>金属</td>
			<td>F</td>
			<td>P</td>
		</tr><tr><td>铜 （N = 61）</td>
			<td>F3,57 = 9.84</td>
			<td><0.0001</td>
		</tr><tr><td>镍 （N = 75）</td>
			<td>F3,71 = 2.35</td>
			<td>0.079</td>
		</tr><tr><td>锌 （N = 64）</td>
			<td>F3,60= 3.79</td>
			<td>0.015</td>
		</tr></tbody></table>表4：金属浓度对显影时间的影响。 显示的是每种金属的单个方差分析的结果。
数据可用性：
所有数据均可在Mendeley61上找到。

Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Tolerance of Cabbage Butterflies to Urban Pollutants at JoVE.com

本文提出了在受控实验室条件下使用人工饮食饲养卷心菜白蝴蝶的详细方案，该方案允许精确操作生命早期营养和毒素暴露。代表性结果表明如何使用该方案测定重金属毒性。

The cabbage white butterfly (Pieris rapae) is an important system for applied pest control research and basic research in behavioral and nutritional ...

在这项研究中，我们有兴趣了解生物体如何处理城市、路边和农田等人为环境。我们使用卷心菜白蝴蝶作为一个系统，因为它们很容易通过实验来操纵。例如，我们正在研究对城市污染物的遗传变异不耐受。我们从不同的地点和种群收集样本，以研究物种或空间的变化。网、冷却器和信封是我们在该领域的主要工具。通过显微镜测量蝴蝶性状，ICP-MS是测量小样品中重金属浓度的最佳方法。目前的实验挑战之一是研究物种之间的变异及其对人类环境的发育调整。主要困难在于在受控的实验条件下饲养各种物种。虽然卷心菜白蝴蝶很容易饲养，但从实验的角度来看，为10或20种以各种植物为食的不同物种找到合适的类似饮食是一项重大挑战。我们对减少接触城市毒素感兴趣，正在探索可以降低重金属和其他城市污染物（如微塑料）毒性的生态干预措施。此外，我们的目标是研究如何在城市空间内设计栖息地，以促进生活在那里的植物和动物的健康，包括人类。

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Research

JoVE Journal

Biology

Rearing the Cabbage White Butterfly (Pieris rapae) in Controlled Conditions: A Case Study with Heavy Metal Tolerance

2.0K 次观看.  University of Minnesota. 在这项研究中，我们有兴趣了解生物体如何处理城市、路边和农田等人为环境。我们使用卷心菜白蝴蝶作为一个系统，因为它们很容易通过实验来操纵。例如，我们正在研究对城市污染物的遗传变异不耐受。我们从不同的地点和种群收集样本，以研究物种或空间的变化。网、冷却器和信封是我们在该领域的主要工具。通过显微镜测量蝴蝶性状，ICP-MS是测量小样品中重金?...

视频: 作者聚焦：调查卷心菜蝴蝶对城市污染物的耐受性 

The cabbage white butterfly (Pieris rapae) is an important system for applied pest control research and basic research in behavioral and nutritional ecology. Cabbage whites can be easily reared in controlled conditions on an artificial diet, making them a model organism of the butterfly world. In this paper, a manipulation of heavy metal exposure is used to illustrate basic methods for rearing this species. The general protocol illustrates how butterflies can be caught in the field, induced to lay eggs in greenhouse cages, and transferred as larvae to artificial diets. The methods show how butterflies can be marked, measured, and studied for a variety of research questions. The representative results give an idea of how artificial diets that vary in components can be used to assess butterfly performance relative to a control diet. More specifically, butterflies were most tolerant to nickel and least tolerant to copper, with a tolerance of zinc somewhere in the middle. Possible explanations for these results are discussed, including nickel hyper-accumulation in some mustard host plants and recent evidence in insects that copper may be more toxic than previously appreciated. Finally, the discussion first reviews variations to the protocol and directions for troubleshooting these methods, before considering how future research might further optimize the artificial diet used in this study. Overall, by providing a detailed video overview of the rearing and measurement of cabbage whites on artificial diets, this protocol provides a resource for using this system across a wide range of studies.

This paper presents a detailed protocol for rearing the cabbage white butterfly in controlled lab conditions with an artificial diet, which allows precise manipulations of early-life nutrition and toxin exposure. The representative results show how heavy metal toxicity can be assayed with this protocol.