该研究得到了生命之翼基金会 （WFL-IT-20/21）、欧盟下一代欧盟-国家恢复和复原力计划 （NRRP）-任务 4 第 2 部分、投资 n.1.4-CUP N.B83C22003930001（托斯卡纳健康生态系统-THE，辐条 8）和 Marina Romoli Onlus 的支持。本手稿仅反映作者的观点和意见，欧盟和欧盟委员会均不能被视为对此负责。数据和元数据可在 Zenodo 10.5281/zenodo 上找到。10433147.图像是使用 Biorender https://www.biorender.com/ 生成的。

脊髓器官型培养物中 h-SC-NES 细胞的长期植入

提交人无需声明任何利益冲突。

对于SCI患者，目前还没有有效的治疗方法。 已经测试了不同的方法，其中最有希望的方法之一是基于再生策略 - 细胞替换。目前，再生医学领域的进步要求人们提供新的平台来测试细胞移植的疗效和安全性，无论是单独使用还是与其他方法结合使用。他们的临床前验证对于进行进一步的临床研究至关重要。SC 器官型培养是研究神经退行性疾病、神经再生和神经发育不同方面以及研究新型治疗方法有效性的有用平台23。特别是，器官型培养物的特定特征（例如维持原始组织结构以及细胞和微环境组成）有利于揭示移植动力学（例如细胞植入、整合、分化和成熟）。
与已发表的方案一致，SC器官型切片可以在健康条件下在培养物中维持约2-3周，这限制了它们用于测试细胞治疗方案所需的长期研究和功能筛选。探索分化和成熟等重要过程，以确定 SC 组织内移植细胞的正确命运，需要长期监测。在动物模型的常见移植过程中，这些细胞过程至关重要。在临床前筛选阶段，模拟体内存在的许多特征的离体系统的可用性将有所帮助。
出于这个原因，在这项工作中，我们提出了一种最佳的长期（≥30 天）SC 器官型培养方法，该方法允许将活的 SC 切片维持长达 90 天，是其通常培养时间框架的三倍。此外，我们展示了稳定的 h-SC-NES 细胞在 SC 切片内植入，并且移植培养物可维持长达 30 天。我们通过观察 GFP 表达来监测细胞植入随时间的变化，以验证细胞存活率高达 DPT 30。30 DPT 后，我们评估细胞凋亡率。在文献中，已报道在 7 DPT 下 SC 切片中移植的 h-SC-NES 细胞凋亡的评估40。在这里，我们扩展了 DPT 30 的细胞凋亡分析，以比较相对于早期时间点 （DPT 7） 的凋亡率。我们发现我们的数据与文献一致，表明移植的 h-SC-NES 细胞如果保持在我们工作中优化的培养条件下，它们也会在以后的时间点存活。这种改进的长期 离体 平台单独使用和移植配置将帮助研究人员进行基于干细胞的SCI移植的临床前筛选。这将使他们能够确定最佳的细胞候选者，用于进一步的 体内 研究，促进移植的成功。此外，在初步筛选后，SC器官型切片也可以与 体内 研究并行使用，以确认和证实在动物模型中观察到的长期细胞动力学和行为，或支持机制研究。
我们的协议详细描述了如何生成这种长期器官型模型，但也应讨论一些关键步骤。关于SC器官型培养物的生成，在手术和培养的第一阶段存在一些挑战。执行良好的手术程序对于生成保持原始组织结构的切片至关重要。如果 SC 在分离过程中被破坏，切片可能会失去其典型的解剖结构，组织损伤会诱发过度的促炎损伤，从而导致不健康的状况和细胞死亡。手术中最具挑战性的阶段是从脊柱中取出皮下细胞瘤，并从孤立的皮下皮带中切除脑膜。这些步骤的成功取决于操作者的经验;因此，建议在开始实验之前进行一段时间的训练。
通过斩波器对 SC 进行冠状切片也是一个具有挑战性的阶段。隔离的 SC 应放置在完全垂直于刀片的切割台上。操作员还应将刀片垂直于切割台放置。这些预防措施对于确保在相同和不同实验之间产生可重复的切片是必要的。另一个重要问题是手术时间有限：整个切片生成过程必须需要 ~30 分钟。如果操作者在手术和切割上花费更多时间，SC组织将受到影响，这可能会影响培养的成功和实验的后续步骤。
一旦将切片放在培养膜上，正确喂养它们就很重要。GDNF 是维持组织恢复和存活所必需的。用切碎器切割对组织是创伤性的，因此，在切割后不久将切片放入冰冷的解剖培养基中，以清除多余的促炎和促死亡分子。然后，将切片用用 GDNF 改性的新鲜培养基放置在培养膜（细胞培养插入物）上，以促进更快的恢复和切片与膜的粘附。由于GDNF的半衰期短，因此在培养的第一周内应每天将GDNF添加到培养基中50,51。我们观察到，切片在培养的第一天需要持续存在 GDNF，以促进组织恢复和活力。无论如何，由于GDNF的存在对整个培养期都很重要，因此强烈建议不要在以后的时间点中断GDNF给药。
在培养的第一周，通过肉眼和显微镜观察切片也很重要。半透明的组织和边界的透明度是切片与膜和活组织正确粘附的标志。乍一看，坏死组织会呈现出极白的白色，而坏死区域在显微镜下会呈现深灰色。培养几周后，组织的形态可能会发生变化：细胞运动和组织与膜的粘附会影响这一过程。例如，我们观察到一些充满细胞的切片中中央管腔的丧失以及背角和腹角形态的丧失。这主要发生在较小的切片上，而其中大多数切片将保持接近原始切片的解剖结构。切片通常是从腰椎或胸部区域产生的，因为通过这种方式，它们可以具有适当的大小以随着时间的推移保持其原始的组织结构：如果它们太小，它们会失去结构，而如果太大，中心区域可能会坏死。因此，我们使用小鼠幼崽的腰部区域来生成具有适当大小的切片，以实现最佳的长期培养，但原则上，可以考虑其他部分。此外，我们选择使用腰部区域，因为腹侧和背侧区域彼此之间更容易区分。此外，该区域呈现出运动神经元和灰质比例较高的组织区域，这些是 SCI 中细胞替代疗法的感兴趣位点。 关于将细胞移植到切片中，主要问题与玻璃微针尖端的破裂有关。如果细胞传入的孔太大，则在显微注射过程中可能会对SC组织造成损伤。如果它太小，细胞堆积会阻塞针头，从而阻碍移植过程。移植程序应在 1 小时内完成，以尽量减少细胞痛苦和死亡。
所提出的方案为不同类型的调查提供了一种最佳和通用的工具。在这里，我们应用我们的长期平台来验证 h-SC-NES 细胞在小鼠 SC 组织内分化的第一阶段移植 30 天。所提方法的主要新颖性是共培养方案的优化。GM 的成分维持 SC 切片和移植的 h-SC-NES 细胞的长期神经元存活。事实上，转基因作为一种无血清培养基，与以前用于器官型切片培养的培养基相比，它维持了移植细胞向神经元命运的分化47。
关于所提出的SCI模型，通常在成年小鼠上进行实验。到目前为止，新生儿和成人 SC 之间最重要的差异与新生儿相对于成年小鼠发现的更高的再生潜力有关52。然而，这种差异对我们提出的协议类型没有影响，因为在这里我们关注的是移植细胞对宿主组织环境的反应，而不是对驻留神经元的再生能力的反应。SCI后新生小鼠和成年小鼠之间的另一个差异与成人中发生的神经胶质瘢痕的形成有关。所提出的模型没有考虑到这一方面，该模型没有考虑由原发性和继发性损伤引起的复杂生理病理过程。
关于应用，该平台还可用于研究移植细胞与SC器官型模型中存在的驻留电路之间的整合。基因工程工具已经在中枢神经系统中用于评估突触连接，并且可以在这方面加以利用53,54,55。特别是，可以通过评估移植细胞和 SC 离体组织之间突触的形成来研究和验证整合。这些长期器官型培养物也可用于检测神经保护剂和神经再生剂或新型分子/材料，或研究涉及 SC 的神经退行性疾病。为了研究特定的神经退行性疾病，该方案需要适应在病理学的相关阶段（即新生儿、青少年、成人）培养由相关模型生成的SC切片，例如携带特定病理学相关突变的转基因小鼠。总之，我们的方案和一般的器官型培养物，作为特定器官的外植体，具有弥合 2D 细胞培养物和体内模型之间差距的特征，证实了它们是基础研究和临床前测试的宝贵工具。

创伤性脊髓损伤 （SCI） 对患者和护理人员的身体、心理和经济后果1.已经进行了许多尝试，以不同的方法促进 SCI 中的轴突再生 2,3,4，并且通过细胞替代疗法在损伤部位的近端和远端神经元之间形成神经元中继，证明了一些有益的效果。人们对细胞疗法的兴趣仍在增长5，因为移植细胞可以发挥许多作用，包括提供营养支持、免疫调节、通过诱导可塑性再生丢失的神经回路、细胞替换和轴突髓鞘再生6。
最近，该领域的主要工作集中在人类神经干/祖细胞 （NSC/NPC） 上7。几项研究表明，NSCs/NPCs 调节星形胶质细胞反应8，促进促再生因子的分泌 9,10，并替换 SCI 中缺失的神经元细胞11,12。然而，支持移植细胞分化为功能性神经元的研究仍然很差。此外，移植细胞在损伤脊髓 （SC） 中的存活率和分化率低13，可能是因为移植细胞需要数周甚至数月才能在体内分化。此外，目前的研究尚未完全阐明细胞替代疗法的许多生化、分子、细胞和功能方面。在这种情况下，需要简单、快速且具有成本效益的模型来研究细胞植入的机制、移植细胞增殖、分化成特定类型或细胞亚群的能力，以及与驻留神经元形成突触的能力。
将组织学研究整合到电生理记录以及转录组和蛋白质组分析中，对于全面理解细胞移植后发生的分子级联反应是必要的。这无疑将加快临床前模型和临床研究中新细胞替代疗法的设计和验证。事实上，迄今为止，使用啮齿动物、大型动物和非人灵长类动物对于阐明移植后的许多细胞过程是值得的14.然而，由于成本高、伦理影响大以及生物体的复杂性，它们的使用往往不直接或不足以揭示生化和分子过程。此外，它们可能存在许多与生物学差异相关的缺点，包括种间（代谢）和种内变异性（性别、年龄）。 这些因素，加上压力情况等外部因素，可能会改变实验的结果及其在对人类的治疗转化方面的可预测性15,16,17。
因此，除了动物模型外，许多研究小组还采用2D体外细胞培养和离体器官型切片（离体培养）。2D细胞培养是在单细胞和/或细胞群水平上研究特定生物过程的最常用系统。然而，单层细胞培养并不能反映在整个生物体中发现的复杂性。缺乏组织结构和生理环境使得 2D 培养系统无法完全模拟所研究组织的关键结构、形态和功能方面 18,19,20。器官型培养可以克服其中的一些问题。器官型模型基于移植组织或器官的片段并将其在有限的时间内保持在体外21,22。特别是，外植组织的切片以精确的厚度生成，使营养物质能够轻松到达切片中的几乎所有细胞。它们可以从中枢神经系统的各个区域产生，例如海马体、下丘脑、小脑、丘脑、大脑皮层、黑质和纹状体以及脊髓23。器官型培养保留了组织结构、细胞的空间分布、细胞多样性和起源器官的环境（即细胞外基质组成）。此外，它们保留了原始的神经活动，细胞之间的连接，特别是外植体后的短距离回路。
与单层培养物和动物模型相比，这些方面为离体培养物提供了一些优势。它们保留了体内发现的关键组织特征，但降低了成本，并有可能进行不同类型的分子、细胞和功能实验，并准确调节培养环境参数 24,25,26,27,28,29.器官型切片也可用于通过类似于特定疾病的关键组织病理学特征来开发不同神经系统疾病的模型30。此外，原始多细胞组织环境的保留使它们成为药物筛选和测试神经保护和神经再生分子和材料的合适平台。
在这项工作中，我们建议使用 SC 器官型培养物作为模型来优化 NSC 移植。这并非微不足道，因为需要最佳的培养条件来保证宿主（SC组织）和移植物（NSC）数周的存活。不同的研究小组移植到器官型培养物中，脑源性和SC衍生的各种类型的细胞。大多数工作展示了间充质干细胞31,32,33，嗅鞘细胞34或NSCs的移植35,36,37,38,39,40，并评估了移植细胞与宿主细胞的相互作用，整个系统的存活率，以及移植的细胞是否分化为神经元或神经元样细胞在离体组织环境中 32,33,41。他们中的一些人评估了移植后细胞的再生潜力，观察它们在组织内的轴突生长37,40,41，少突胶质细胞移植前体的髓鞘化能力42，移植细胞向宿主组织的迁移43，以及移植细胞是否释放了推动促再生环境的因子31.目前研究的一个局限性是它们没有长期探索植入。
考虑到 NSC 似乎需要数周时间才能在体内分化 44,45，本研究的重点是如何生成和维持长期（≥30 天）小鼠 SC 切片长达 90 天。研究发现，切片保留了其原始的解剖结构，并随着时间的推移保持低而稳定的凋亡率和高细胞活力。我们观察到神经元标记物 RNA 结合 fox-1 同源物 3 （RBFOX3） 和神经丝轻链 （NFL） 的弥漫表达，随着时间的推移，后者在切片周围轴突发芽呈增加趋势，证明了它们的健康状况。此外，在神经元分化的第一阶段，我们成功地将表达GFP的人SC衍生的神经上皮干（h-SC-NES）移植到SC切片中。移植后维持 NSC 移植物 30 天，细胞在培养的所有期间均显示 GFP 表达。还发现移植后第二天 （DPT） 30 的细胞凋亡率与相同细胞40 中在 DPT 7 处观察到的凋亡率值一致。 细胞似乎植入组织环境并存活长达数周。
总之，我们的数据表明，可以在培养物中将 SC 器官型切片维持 3 个月，而不会影响其原始细胞结构和组织环境。最重要的是，它们可以用于在进行 体内 实验之前测试细胞疗法，从而降低成本和实验时间。在这里，我们详细说明了产生小鼠SC器官型切片的所有段落以及如何长期（≥30天）维持它们。此外，我们还深入解释了如何将鼻咽癌移植到切片中，以及如何保持鼻咽癌以进行下游分析。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-cleaved Caspase-3,&#160; (Asp175) (5A1E) (Rabbit)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9661S</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP (Mouse) - monoclonal</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>G6539</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Human Nuclei (Mouse) - monoclonal, clone 235-1&#160;</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>MAB1281</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Human Nuclei (Rabbit)</td>
			<td>NeoBiotechnologies</td>
			<td>RBM5-346-P1</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NeuN (RBFOX3) (Rabbit) - polyclonal</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>ABN78</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NFL (Mouse)</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>MAB1615</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NFL H-Phospho (Rabbit) -polyclonal</td>
			<td>Biologend</td>
			<td>840801</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Polymount</td>
			<td>Poly-sciences</td>
			<td>18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC7074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>118364227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture graded water</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>W3500-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from rat tail</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>C7661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope - A1 Confocal Microscope (Eclipse Ti)</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>gf144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-2</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>03-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>SRP3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries, 3.5&#34;&#160;</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti Mouse IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti Mouse IgG Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21236</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti Rabbit IgG Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11011</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti Rabbit IgG Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21244</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph Pad-Prism</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td></td>
			<td>Software for Statistical Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-050</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral prep</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>17446-LV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L32250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11090-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>to load cells in the needle for transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell cell culture membrane</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscroscope cover glasses</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>ECN 631-1572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (35mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pasteur pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1171.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV830</td>
			<td>Microinjector for transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>SWAN3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle #3</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope for imaging and acquisition</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope for surgery</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers-Dumont #5-inox</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Scissors, 8.5 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical micropipette puller</td>
			<td>Shutter Instrument</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254/50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term mouse spinal cord organotypic slice culture as a platform for validating cell transplantation in spinal cord injury

由于病理生理学复杂的脊髓损伤 （SCIs） 方法仍然缺乏。最有前途的再生方法之一是基于干细胞移植，以替换丢失的组织并促进功能恢复。在进行更昂贵和耗时的动物试验之前，应 在体外 和 体外 更好地探索这种方法的安全性和有效性。在这项工作中，我们展示了建立一个基于小鼠脊髓 （SC） 器官型切片移植人类神经干细胞的长期平台，以测试 SCI 的细胞替代疗法。
标准 SC 器官型培养物 在体外维持约 2 或 3 周。在这里，我们描述了一种优化的协议，用于长达 90 天的长期维护（≥30 天）。用于长期培养 SC 切片的培养基也针对将神经干细胞移植到器官型模型中进行了优化。将携带绿色荧光蛋白 （GFP） 报告基因的人 SC 衍生神经上皮干 （h-SC-NES） 细胞移植到小鼠 SC 切片中。移植后30天，细胞仍显示GFP表达和低凋亡率，表明优化的环境维持了它们在组织内的存活和整合。该协议代表了在SC组织中有效测试细胞替代疗法的有力参考。该平台将使研究人员能够对不同的细胞移植疗法进行 体外 预筛选，帮助他们在进行 体内 实验之前选择最合适的策略。

Traumatic spinal cord injury (SCI) has devastating physical, psychological, and economic consequences for patients and caregivers1. Many attempts have been made to promote axonal regeneration in SCI with different approaches2,3,4 and some beneficial effects were demonstrated by the formation of neuronal relays between proximal and distal neurons in the injury site through cell replacement therapies. The interest in cell therapies is still growing5 since transplanted cells can play many roles, including providing trophic support, immune modulation, regenerating lost neural circuits through induction of plasticity, cell replacement, and axon remyelination6.
Recently, the main effort in the field focused on human neural stem/progenitor cells (NSCs/NPCs)7. Several studies suggest that NSCs/NPCs modulate astrocyte response8, promote the secretion of proregenerative factors9,10, and replace missing neuronal cells in SCI11,12. However, studies that support the differentiation of transplanted cells into functional neurons are still poor. Moreover, transplanted cell survival and differentiation in the injured spinal cord (SC) are low13, possibly because transplanted cells take several weeks, even months, to differentiate in vivo. Additionally, current studies have not completely elucidated many biochemical, molecular, cellular, and functional aspects of cell replacement therapies. In this context, simple, fast, and cost-effective models are required to study the mechanisms of cell engraftment, the ability of engrafted cells to proliferate, differentiate into specific types or subpopulations of cells, and form synapses with resident neurons.
Integrating histological studies into electrophysiological recording and transcriptome and proteome profiling is necessary for a full comprehension of the molecular cascade occurring after cell transplantation. This certainly will speed up the design and validation of new cell replacement therapies in preclinical models and clinical studies. Indeed, to date, the use of rodents, large animals, and non-human primates has been worthwhile for elucidating many cellular processes after transplantation14. However, due to the high cost, the high ethical impact, as well as the complexity of the organism, their use is often not straightforward or not adequate to unravel biochemical and molecular processes. In addition, they may present many disadvantages correlated with biological differences, both interspecies (metabolism) and intraspecies variability (sex, age).&#160;&#160;These factors, together with external factors such as stressful situations, could alter the outcome of an experiment and their predictability in terms of therapeutic translation to humans15,16,17.
Thus, many groups employ 2D in vitro cell culture and ex vivo organotypic slices (ex vivo cultures) in addition to animal models. 2D cell culture is the most commonly used system for studying specific biological processes at a single-cell and/or cell population level. Nevertheless, monolayer cell cultures do not reflect the complexity found in a whole organism. The lack of tissue structures and&#160;physiological environment does not allow the 2D culture systems to completely emulate key structural, morphological, and functional aspects of the investigated tissue18,19,20. Organotypic cultures can overcome some of these issues. Organotypic models are based on explanting a fragment of a tissue or organ and maintaining it ex vivo for a limited period21,22. In particular, slices of the explanted tissue are generated with a precise thickness that allows nutrients to easily reach almost all the cells in the slices. They&#160;can be generated from various regions of the central nervous system, such as the hippocampus, hypothalamus, cerebellum, thalamus, cerebral cortex, substantia nigra and striatum, and spinal cord23. Organotypic cultures retain the tissue architecture, the spatial distribution of cells, the cellular diversity, and the environment (i.e., extracellular matrix composition) of the organ of origin. Moreover, they preserve the original neural activity, connections between cells, and in particular, short-distance circuits after the explant.
These aspects provide some advantages for ex vivo cultures with respect to both monolayer cultures and animal models. They retain key tissue features found in vivo but with the reduction of the costs and the possibility to perform different types of molecular, cellular, and functional experiments with an accurate regulation of the culture environmental parameters24,25,26,27,28,29. Organotypic slices can also be exploited to develop models for different neurological disorders by resembling key histopathological features of specific conditions30. Moreover, the retention of the original multicellular tissue environment renders them appropriate platforms for drug screening and for testing neuroprotective and neuro-regenerative molecules and materials.
In this work, we propose the use of SC organotypic cultures as a model to optimize NSC transplants. This is not trivial since optimal culturing conditions are required to guarantee the survival of both the host (SC tissue) and the transplant (NSCs) for weeks. Different research groups engrafted in organotypic cultures, brain-derived and SC-derived, various types of cells. Most of the works showed the transplantation of mesenchymal stem cells31,32,33, olfactory ensheathing cells34, or NSCs35,36,37,38,39,40 and evaluated the interactions of engrafted cells with the host cells, the survival of the whole system, and whether the transplanted cells differentiated into neurons or neuron-like cells inside the ex vivo tissue environment32,33,41. Some of them evaluated the regenerative potential of cells after transplant, observing their axonal growth inside the tissue37,40,41, the myelinating ability of engrafted precursors of oligodendrocytes42, the migration of engrafted cells into the host tissue43, and whether the transplanted cells released factors pushing towards a proregenerative environment31. One limitation of the current studies is that they do not explore the engraftment for a long-term period.
Considering that NSCs seem to require several weeks to differentiate in vivo44,45, this study focuses on how to generate and maintain long-term (&#8805;30 days) mouse SC slices for up to 90 days. Slices were found to retain their original anatomical structure and to maintain a low and stable apoptotic rate over time and high cell viability. We observed diffuse expression of neuronal markers RNA binding fox-1 homolog 3 (RBFOX3) and neurofilament light chain (NFL), with the latter showing an increasing trend of axonal sprouting around the slices over time, attesting to their healthy condition. Moreover, we successfully transplanted into the SC-slices GFP-expressing human SC-derived neuroepithelial stem (h-SC-NES) cells at the first stages of neuronal differentiation. The NSC graft was maintained for 30 days after transplant and cells showed GFP expression for all the period in culture. The apoptotic rate of cells at day post-transplant (DPT) 30 was also found to be in line with respect to the apoptotic rate value observed at DPT 7 in the same cells40. Cells seemed to engraft into the tissue environment and survived up to several weeks.
In summary, our data demonstrate that it is possible to maintain in culture SC organotypic slices for 3 months without compromising their original cytoarchitecture and the tissue environment. Most importantly, they can be exploited to test cell therapies before proceeding with an in vivo experiment, thus reducing the costs and the experimental time. Here, we illustrate in detail all the passages to generate mouse SC organotypic slices and how to maintain them for long-term periods (&#8805;30 days). Moreover, we deeply explain how to perform NPC transplantation into the slices and how to maintain them for downstream analysis.

作者聚焦：用于推进脊髓再生疗法的长期脊髓切片培养

长期小鼠脊髓器官型切片培养作为验证脊髓损伤细胞移植的平台

We are interested in developing a promising regenerative approach to address spinal cord injuries. In this paper, we validate spinal cord organotypic model for testing cellular replacement therapies in spinal cord research. So far, spinal cord organotypic models are maintained in culture for two or three weeks in vitro.And subculture media are suboptimal for neural stem cell engraftment, differentiation, and maturation. Cell replacement therapies still require the improvement to announce the ability of the grafted cells to reconstitute the lost circuits. Through this protocol, we provide a novel, long-term ex vivo platform to tackle cell transplant related issue like survival, integration, and maturation rate of the engrafted neural stem cells.This platform will be helpful for researchers to find the best strategy for cell transplantation, reducing the number of animals required for in vivo validation. Our protocol is simple, fast, and cost-effective to perform proof of concept and optimization studies.

所描述的方法允许在P3阶段建立小鼠的SC器官型切片，并在健康条件下将其长时间维持在培养物中。此外，我们还展示了将细胞移植到切片中并共同培养它们长达 30 天的方案（图 1）。首先，我们展示了培养条件的优化和适用于用移植细胞长时间培养SC切片的方案（图2A）。在OM中，从DEV 0到DEV 2生成并维持切片，OM最初被提议作为维持SC切片47的最佳介质。然而，由于血清蛋白的存在，该培养基可能无法维持移植的神经前体细胞的神经元分化和成熟。事实上，在 DEV 3 中，我们测试了从 OM 到 GM 的转换，这是一种含有 Neurobasal 加 B27 的配方，它支持神经存活，并且不含血清，它会抑制正确的神经元分化，反而促进神经胶质命运48,49。
图2B显示了将DEV 3的培养基从OM切换到GM所获得的结果，与未接收到开关的SC切片（对照切片在OM中培养）相比。我们使用切片内NFL信号的分布作为神经元完整性的标志（图2B，C）。DEV 7 的切片在两种培养条件下都是健康的，显示出它们内部神经丝（NFL，绿色）的弥散分布。在 DEV 10 中，与在 OM 中培养的对照切片相比，在 GM 中培养的切片似乎更健康，正如 NFL 染色分布所记录的那样。我们还估计了图2B的代表性图像中显示的切片的NFL+面积（% NFL+面积/DAPI+面积）。估计的 NFL+ 面积在图 2C 的直方图中表示，证实了在两种条件下，NFL 信号在 DEV 7 处的切片中扩散分布。然而，在 DEV 10 时，对于 OM 培养条件，NFL 染色覆盖的估计面积会减少。
这些数据表明，在 DEV 3 时切换到 GM 对于 SC 切片的长时间培养 （DEV 10） 具有良好的耐受性。下一步，我们在更长的时间点测试了 GM：DEV 30、DEV 60 和 DEV 90。如图 3A，B 所示，切片在培养物中保持健康，直到 DEV 90。在每个时间点的切片中都发现 NFL 染色广泛存在，从中心区域出发的神经突切片周围有弥漫性发芽。事实上，我们估计了图3A所示切片的NFL+面积，并且随着时间的推移而增加，如图3B的直方图所示。我们还观察到神经元标记物RBFOX3的阳性，为切片的神经元分化提供了另一条证据。在每个时间点，我们还通过评估不同切片中对aCASP3阳性的细胞数量来检查凋亡率（图4A，B）。分析按照协议第 10.2 节中的描述进行。发现每个时间点的凋亡率（% aCASP3+ 细胞/DAPI+ 细胞总数）非常低（DEV 30、60 和 90 ± 分别为 0.85 ± 0.52%、0.71 0.27%、0.66 ± 0.45%），三个考虑的时间点之间没有显着差异（p 值 > 0.05，图 4B）。这些数据表明，与 aCASP3 相关的凋亡率在一段时间内保持稳定，并且与切片中 NFL 的广泛分布（图 4A）一起证实了切片在每个时间点的存活。
为了支持之前的数据，我们还进行了活/死测定，以评估切片在三个不同时间点的活力。我们使用钙黄绿素（绿色染色）来标记活细胞和代谢活性细胞，并使用 Sytox（青色染色）来评估细胞死亡。 如图 4C 中的直方图所示，从 DEV 30 到 DEV 90，代谢活性细胞的百分比略有增加（DEV 30、60 和 90 分别为 93.17 ± 5.21%、96.43 ± 3.02%、96.33 ± 3.10%），在最后两个时间点之间保持稳定（DEV 30 vs DEV 60 p 值 = 0.018;DEV 30 与 DEV 90 p 值 = 0.027;DEV 60 与 DEV 90 p 值 = 0.99）。我们发现随着时间的推移，细胞死亡水平较低（DEV 30、60 和 90 分别为 6.83 ± 5.21%、3.57 ± 3.02%、3.66 ± 3.10%），并且发现 DEV 30 和以后的时间点 DEV 60 和 DEV 90 之间存在显着差异（DEV 30 vs DEV 60 p 值 = 0.018;DEV 30 与 DEV 90 p 值 = 0.027;DEV 60 与 DEV 90 p 值 = 0.99）。这些数据与细胞凋亡率相关联，证实了切片随时间推移的存活率，并支持所执行的长期培养方案的有效性。
一旦确定了 SC 切片长时间培养的可行性，我们就通过在神经元分化的第一阶段移植 h-SC-NES 细胞来挑战该系统。我们测试了 h-SC-NES 细胞，因为它们在 SCI 治疗12 中显示出有希望的结果。将h-SC-NES细胞移植到小鼠SC切片中的程序在方案第6节中描述。SC 切片和移植的 h-SC-NES 细胞维持至 DPT 30。在分化的 DIV 10（神经前体阶段）将细胞移植到 DEV 4 器官型切片中，如图 5A 的方案方案所示。监测移植细胞在培养物中 GFP 的表达长达 30 天。 图5B 显示了在不同DPT下移植GFP+ 细胞的SC切片的代表性实时图像。GFP随时间推移的稳定表达（图5B 和 图6A）表明，在先前优化的培养条件下，细胞存活到SC组织中。我们还检查了移植细胞的凋亡率，如方案第10.2节所述。发现30 DPT后凋亡率（% aCASP3 + 细胞/胡-Nu + 细胞总数）非常低（0.44±0.34%）（图6B）。此外，发现 DPT 30 时的凋亡率与 DPT 7 时相同类型细胞的凋亡率一致，如先前报道的40 所示，表明培养物随着时间的推移而稳定。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig01.jpg"> 图 1：协议的工作流程。 代表性方案，显示了所执行协议的一般工作流程。（A） 左图，总结了小鼠幼崽在 P3 处分离的 SC 产生小鼠 SC 切片和 SC 器官型切片的长期培养的方案。（B） 右边是总结将表达 GFP 的 h-SC-NES 细胞移植到小鼠 SC 器官型切片中的方案。移植细胞在移植后维持 30 天。缩写：h-SC-NES=人脊髓来源的神经上皮茎;GFP = 绿色荧光蛋白;DEV = 离体日;DPT = 移植后第二天;NFL = 神经丝轻链;RBFOX3= RNA 结合 fox-1 同源物 3;aCASP3 = 活性 Caspase-3;SC=脊髓。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig01large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig02v2.jpg"> 图2：长期培养条件的优化。 （A） 测试OM和GM的协议的代表性方案。 对照组的OM维持至DEV 7-10。在DEV 3时将培养基切换到GM以处理过的切片;然后，将它们固定在 DEV 7-10 上，以便与对照进行比较。（B） 比较在不同条件下培养的 DEV 7 和 10 的小鼠 SC 器官型切片的代表性图像。对切片进行细胞骨架标记物神经丝（NFL，绿色）染色。用转基因培养的切片中 NFL 染色的广泛分布表明总体存活率和分化。细胞核用DAPI复染。比例尺 = 500 μm。 （C） 图 1B 所示切片中 NFL 覆盖面积估计值的代表性直方图。在 DEV 10 时，在 OM 培养条件下，NFL 表面积减小。缩写：DEV = day ex vivo;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚;NFL = 神经丝轻链。;OM = 器官型培养基;GM = 移植培养基;SC = 脊髓。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig02large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig03v3.jpg"> 图 3：长期培养的小鼠 SC 器官型切片。 （A） 切片在培养物中保持至 DEV 90。免疫荧光测定显示细胞骨架标记物神经丝（NFL，绿色）和核神经元标记物 RBFOX3（红色）分布广泛，证明了它们在长期培养后的健康状况和神经元身份。值得注意的是，随着时间的推移，NFL+ 轴突会在切片周围弥漫性地发芽。细胞核用DAPI复染。比例尺 = 500 μm。 （B） 图 A 中显示的 NFL+ 面积和时间估计值以及 RBFOX3+ 面积估计值的代表性直方图 。 NFL+ 神经突面积随着时间的推移而增加。缩写：DEV = day ex vivo;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚;NFL = 神经丝轻链;SC = 脊髓;RBFOX3= RNA 结合 fox-1 同源物 3。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig03large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig04.jpg"> 图 4：SC 切片中细胞活力随时间的评估。 （A） DEV 60 处的 aCASP3（红色）和 NFL（绿色）染色的器官型切片的代表性图像。比例尺 = 100 μm。 NFL 显示漫反射图案。稀有细胞的凋亡标志物 aCASP3 呈阳性（插图：1-2-3）。（B）不同时间点切片凋亡率分析。平均 ± SD，N（重复）= 6 个切片，n（总细胞数）>每个切片 1,000，Kruskal-Wallis 检验，多重比较，p 值 > 0.05。凋亡率随时间推移保持稳定。在图 A 的插图 1-2-3 中，可以观察到 aCASP3 阳性细胞的细节（红色染色，白色箭头）。小红点标记细胞碎片和脓结核。比例尺 = 50 μm。 （C） 在 DEV 90 时对 SC 切片进行的活/死测定的代表性图像：代谢活性细胞用钙黄绿素标记为绿色，而死亡和受损细胞用 Sytox 标记浅蓝色（青色）。两个直方图显示了钙黄绿素（左侧）和 Sytox（右侧）阳性的细胞占细胞总数的百分比。对于均值± SD，N（重复）= 6 个切片，n（总细胞数）>每个切片 1,000，Kruskal-Wallis 检验，多重比较， DEV 30 vs DEV 60 p 值 = 0.018;DEV 30 与 DEV 90 p 值 = 0.027;DEV 60 与 DEV 90 p 值 > 0.99。缩写：DEV = day ex vivo;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚;NFL = 神经丝轻链;SC = 脊髓;aCASP3 = 活性半胱天冬酶-3。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig04large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig05.jpg"> 图 5：将 h-SC-NES 细胞移植到小鼠器官型切片中。 （A） 移植方案的代表性方案。细胞在分化的 DIV 10 时作为神经前体移植到 DEV 4 器官型切片中。（B） 移植用表达 GFP 的 h-SC-NES 细胞移植的小鼠器官型切片的代表性图像，直至 DPT 30。用携带 GFP 基因的慢病毒载体转导细胞。GFP随时间推移的表达证实了它们的活力和对切片环境的适应性。比例尺 = 500 μm。缩写：DIV = 分化前的第一天;h-SC-NES = 人脊髓来源的神经上皮茎;GFP = 绿色荧光蛋白;DEV = 离体日;OM = 器官型培养基;GM = 移植培养基;DPT = 移植后天数。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig05large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig06.jpg"> 图 6：移植后 30 天后移植的 h-SC-NES 细胞的凋亡率评估。 （A） 移植有表达 GFP 的 h-SC-NES 细胞的小鼠器官型切片的代表性图像。用携带 GFP 基因的慢病毒载体转导细胞，以便在移植后监测它们进入切片。GFP随时间推移的表达证实了它们的活力和对切片环境的适应性。显示的时间点为 DPT 30;对细胞进行人核（青色）和 aCASP3（红色）染色。比例尺 = 150 μm。 （B） 左侧是 DPT 30 时移植成片的细胞凋亡分析的代表性饼图（N（重复）= 5 个切片，n （细胞） = 5,000），右侧是 胡-Nu+ 细胞的插图和对 aCASP3 呈阳性的细胞的详细信息（白色箭头）。比例尺 = 75 μm。小红点标记细胞碎片和脓结核。缩写：h-SC-NES=人脊髓来源的神经上皮茎;GFP = 绿色荧光蛋白;DPT = 移植后第二天;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚;NFL = 神经丝轻链;aCASP3 = 活性半胱天冬酶-3;胡-努 = 人类细胞核。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig06large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
表1：本协议中使用的溶液组成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704_Tables%20of%20Solutions%20rev.xlsx" target="_blank">请按此下载此表格。</a>

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Long-Term Spinal Cord Slice Culture for Advancing Spinal Cord Regeneration Therapies at JoVE.com

在本文中，我们提供了一种可重复的方法来生成和维持移植神经干细胞的长期脊髓器官型切片，作为测试细胞替代疗法的 离体 模型。

Resolutive cures for spinal cord injuries (SCIs) are still lacking, due to the complex pathophysiology. One of the most promising regenerative approaches ...

我们有兴趣开发一种有前途的再生方法来解决脊髓损伤。在本文中，我们验证了脊髓器官型模型在脊髓研究中测试细胞替代疗法。到目前为止，脊髓器官型模型在体外培养物中维持两到三周。而传代培养基对于神经干细胞植入、分化和成熟来说是次优的。细胞替代疗法仍然需要改进，以宣布移植细胞重建丢失的电路的能力。通过该协议，我们提供了一个新颖的、长期的离体平台，以解决细胞移植相关问题，如移植神经干细胞的存活、整合和成熟率。该平台将有助于研究人员找到细胞移植的最佳策略，减少体内验证所需的动物数量。我们的方案简单、快速且经济高效，可用于执行概念验证和优化研究。

long-term-mouse-spinal-cord-organotypic-slice-culture-as-platform-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Long-Term Mouse Spinal Cord Organotypic Slice Culture as a Platform for Validating Cell Transplantation in Spinal Cord Injury

699 次观看.  University of Pisa. 我们有兴趣开发一种有前途的再生方法来解决脊髓损伤。在本文中，我们验证了脊髓器官型模型在脊髓研究中测试细胞替代疗法。到目前为止，脊髓器官型模型在体外培养物中维持两到三周。而传代培养基对于神经干细胞植入、分化和成熟来说是次优的。细胞替代疗法仍然需要改进，以宣布移植细胞重建丢失的电路的能力。通过该协议，我们提供了一个新颖的、长期的?...

视频: 作者聚焦：用于推进脊髓再生疗法的长期脊髓切片培养

Resolutive cures for spinal cord injuries (SCIs) are still lacking, due to the complex pathophysiology. One of the most promising regenerative approaches is based on stem cell transplantation to replace lost tissue and promote functional recovery. This approach should be further explored better in vitro and ex vivo for safety and efficacy before proceeding with more expensive and time-consuming animal testing. In this work, we show the establishment of a long-term platform based on mouse spinal cord (SC) organotypic slices transplanted with human neural stem cells to test cellular replacement therapies for SCIs.
Standard SC organotypic cultures are maintained for around 2 or 3 weeks in vitro. Here, we describe an optimized protocol for long-term maintenance (&#8805;30 days) for up to 90 days. The medium used for long-term culturing of SC slices was also optimized for transplanting neural stem cells into the organotypic model. Human SC-derived neuroepithelial stem (h-SC-NES) cells carrying a green fluorescent protein (GFP) reporter were transplanted into mouse SC slices. Thirty days after the transplant, cells still show GFP expression and a low apoptotic rate, suggesting that the optimized environment sustained their survival and integration inside the tissue. This protocol represents a robust reference for efficiently testing cell replacement therapies in the SC tissue. This platform will allow researchers to perform an ex vivo pre-screening of different cell transplantation therapies, helping them to choose the most appropriate strategy before proceeding with in vivo experiments.

In this paper, we provide a reproducible method to generate and maintain long-term spinal cord organotypic slices transplanted with neural stem cells as an ex vivo model for testing cellular replacement therapies.