Die Studie wurde unterstützt von der Wings for Life Foundation (WFL-IT- 20/21), dem EU-Nationalen Aufbau- und Resilienzplan (NRRP) der Europäischen Union Next-Generation – Mission 4 Komponente 2, der Investition Nr. 1.4-CUP N. B83C22003930001 (Tuscany Health Ecosystem-THE, Spoke 8) und der Marina Romoli Onlus. Dieses Manuskript gibt nur die Ansichten und Meinungen der Autoren wieder, weder die Europäische Union noch die Europäische Kommission können dafür verantwortlich gemacht werden. Daten und Metadaten sind auf Zenodo 10.5281/zenodo verfügbar.10433147. Die Bilder wurden mit Biorender https://www.biorender.com/ erzeugt.

Langzeittransplantation von h-SC-NES-Zellen in organotypische Kulturen des Rückenmarks

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Es gibt immer noch keine wirksame Behandlung für Patienten mit Querschnittlähmung. Verschiedene Ansätze wurden getestet, und einer der vielversprechendsten basiert auf einer regenerativen Strategie - dem Zellersatz. Derzeit erfordern die Fortschritte im Bereich der regenerativen Medizin neuartige Plattformen, um die Wirksamkeit und Sicherheit von Zelltransplantaten allein oder in Kombination mit anderen Ansätzen zu testen. Ihre präklinische Validierung ist für die Durchführung weiterer klinischer Studien unerlässlich. Organotypische Kulturen des SC sind eine nützliche Plattform, um verschiedene Aspekte der Neurodegeneration, der neuronalen Regeneration und der Neuroentwicklung zu untersuchen und die Wirksamkeit neuartiger therapeutischer Ansätze zu untersuchen23. Insbesondere spezifische Merkmale der organotypischen Kulturen, wie die Beibehaltung der ursprünglichen Histoarchitektur und der Zell- und Mikroumgebungszusammensetzung, sind vorteilhaft, um die Transplantationsdynamik zu entschlüsseln, wie z. B. Zelltransplantation, Integration, Differenzierung und Reifung.
In Übereinstimmung mit den veröffentlichten Protokollen können subkutanische organotypische Schnitte unter gesunden Bedingungen etwa 2-3 Wochen lang in Kultur gehalten werden, was ihre Verwendung für Langzeituntersuchungen und funktionelles Screening einschränkt, die für Testschemata der Zelltherapie erforderlich sind. Die Erforschung wichtiger Prozesse wie Differenzierung und Reifung hin zum korrekten Verbleib transplantierter Zellen im SC-Gewebe erfordert eine Langzeitüberwachung. Diese zellulären Prozesse sind bei gängigen Transplantationen in Tiermodellen von entscheidender Bedeutung. Die Verfügbarkeit eines ex vivo-Systems , das viele in vivo vorhandene Merkmale nachahmt, wäre in der präklinischen Screening-Phase hilfreich.
Aus diesem Grund schlagen wir in dieser Arbeit eine optimale langfristige (≥30 Tage) organotypische SC-Kulturmethode vor, die es ermöglicht, lebensfähige SC-Scheiben für bis zu 90 Tage zu erhalten und damit ihren üblichen Kulturzeitraum zu verdreifachen. Darüber hinaus zeigen wir eine stabile h-SC-NES-Zelltransplantation in SC-Schnitten und die Aufrechterhaltung der Transplantatkultur für bis zu 30 Tage. Wir überwachten die Zelltransplantation im Laufe der Zeit, indem wir die GFP-Expression beobachteten, um das Überleben der Zellen bis zu DPT 30 zu verifizieren. Nach 30 DPT bewerteten wir die Apoptoserate der Zellen. In der Literatur wurde über die Bewertung der Apoptose von transplantierten h-SC-NES-Zellen in SC-Schnitten bei 7 DPT berichtet40. In dieser Arbeit haben wir die Zellapoptose-Analyse an DPT 30 erweitert, um die apoptotische Rate in Bezug auf den früheren Zeitpunkt (DPT 7) zu vergleichen. Wir fanden heraus, dass unsere Daten mit der Literatur übereinstimmen, was darauf hindeutet, dass transplantierte h-SC-NES-Zellen auch zu einem späteren Zeitpunkt überleben, wenn sie unter den in unserer Arbeit optimierten Kulturbedingungen gehalten werden. Diese verbesserte Langzeit-Ex-vivo-Plattform allein und in der Transplantationskonfiguration wird Forschern beim präklinischen Screening auf stammzellbasierte Transplantationen auf Rückenmarksverletzung helfen. Auf diese Weise können sie den besten Zellkandidaten für weitere in vivo-Studien identifizieren, die den Erfolg der Transplantationen fördern. Darüber hinaus könnten nach einem ersten Screening auch organotypische Schnitte parallel zu den In-vivo-Studien verwendet werden, um die in Tiermodellen beobachtete langfristige zelluläre Dynamik und Verhaltensweisen zu bestätigen und zu bestätigen oder um mechanistische Studien zu unterstützen.
Unser Protokoll beschreibt im Detail, wie dieses langfristige organotypische Modell generiert werden kann, aber es sollten auch einige kritische Schritte besprochen werden. Bei der Generierung der organotypischen SC-Kulturen gibt es einige Herausforderungen während der Operation und in den ersten Phasen der Kultur. Ein gut durchgeführter chirurgischer Eingriff ist unerlässlich, um Slices zu erzeugen, die die ursprüngliche Histoarchitektur beibehalten. Wenn der SC während der Isolierung ruiniert wird, können die Scheiben ihre typische anatomische Struktur verlieren und die Gewebeschädigung kann zu einer übermäßigen entzündungsfördernden Beleidigung führen, die zu ungesunden Bedingungen und zum Zelltod führt. Die schwierigste Phase während der Operation ist die Extraktion des SC aus der Wirbelsäule und die Entfernung der Hirnhäute aus dem isolierten SC. Der Erfolg dieser Schritte hängt von der Erfahrung des Bedieners ab. Daher wird eine Einarbeitungsphase empfohlen, bevor mit den Experimenten begonnen wird.
Auch die koronale Sektion des SC durch einen Hubschrauber ist eine herausfordernde Phase. Der isolierte SC sollte genau senkrecht zur Klinge auf dem Mähdeck platziert werden. Der Bediener sollte das Messer auch senkrecht zum Mähdeck platzieren. Diese Vorsichtsmaßnahmen sind notwendig, um die Erzeugung reproduzierbarer Schichten zwischen demselben und unterschiedlichen Experimenten zu gewährleisten. Ein weiterer wichtiger Punkt ist, dass die Zeit für die Operation begrenzt ist: Die gesamte Schnitterzeugung muss ~30 Minuten dauern. Wenn der Bediener mehr Zeit für die Operation und das Schneiden aufwendet, leidet das SC-Gewebe, was den Erfolg der Kultur und die nächsten Schritte des Experiments beeinträchtigen kann.
Sobald die Scheiben auf die Kulturmembran gelegt wurden, ist es wichtig, sie richtig zu füttern. GDNF ist notwendig, um die Erholung und das Überleben des Gewebes aufrechtzuerhalten. Das Schneiden mit einem Zerkleinerer ist traumatisch für das Gewebe und aus diesem Grund werden die Scheiben kurz nach dem Schnitt in ein eiskaltes Seziermedium gelegt, um den Überschuss an entzündungsfördernden und todfördernden Molekülen zu entfernen. Dann werden die Scheiben mit frischem Medium auf die Kulturmembranen (Zellkulturinsertionen) gelegt, das mit GDNF modifiziert ist, um eine schnellere Erholung und die Adhäsion der Scheiben an der Membran zu fördern. GDNF sollte dem Medium in der ersten Woche in Kultur wegen seiner kurzen Halbwertszeit täglich zugesetzt werden50,51. Wir haben beobachtet, dass die Scheiben in den ersten Tagen der Kultur die kontinuierliche Anwesenheit von GDNF benötigen, um die Regeneration und Lebensfähigkeit des Gewebes zu fördern. Da die GDNF-Präsenz für den gesamten Kulturzeitraum wichtig ist, wird in jedem Fall dringend davon abgeraten, die GDNF-Verabreichung zu einem späteren Zeitpunkt zu unterbrechen.
In der ersten Woche in Kultur ist es auch wichtig, die Scheiben makroskopisch mit dem Auge und am Mikroskop zu überprüfen. Durchscheinendes Gewebe und Transparenz der Ränder sind Zeichen für eine gute Haftung der Scheiben an der Membran und für lebensfähiges Gewebe. Das nekrotische Gewebe erscheint auf den ersten makroskopischen Blick extrem weiß und die nekrotischen Bereiche erscheinen am Mikroskop dunkelgrau. Nach einigen Wochen in Kultur kann sich die Morphologie des Gewebes verändern: Zellbewegungen und die Adhäsion des Gewebes an der Membran können diesen Prozess beeinflussen. Wir beobachteten zum Beispiel den Verlust des zentralen Lumens in einigen mit Zellen gefüllten Schnitten und den Verlust der Morphologie des Hinter- und Bauchhorns. Dies geschieht vor allem bei kleineren Scheiben, während die meisten von ihnen eine anatomische Struktur beibehalten, die der ursprünglichen nahe kommt. Schnitte werden in der Regel aus dem lumbalen oder thorakalen Bereich erzeugt, da sie auf diese Weise die entsprechende Größe haben können, um ihre ursprüngliche Histoarchitektur im Laufe der Zeit beizubehalten: Wenn sie zu klein sind, verlieren sie ihre Architektur, während sie, wenn sie zu groß sind, in der zentralen Region in Nekrose geraten können. So haben wir die Lendenwirbelsäule von Mausjungtieren verwendet, um Scheiben mit der richtigen Größe für eine optimale Langzeitkultivierung zu erzeugen, aber im Prinzip können auch andere Segmente in Betracht gezogen werden. Darüber hinaus haben wir uns für die Lendenwirbelsäule entschieden, da ventrale und dorsale Regionen besser voneinander unterscheidbar sind. Darüber hinaus weist diese Region Gewebebereiche mit einem höheren Anteil an Motoneuronen und grauer Substanz auf, die für Zellersatztherapien bei Rückenmarksverletzung von Interesse sind. Bei der Transplantation von Zellen in die Scheiben hängt das Hauptproblem mit dem Bruch der Glasmikronadelspitze zusammen. Wenn das Loch für den Zelldurchgang zu groß ist, kann es während der Mikroinjektion zu einer Schädigung des SC-Gewebes kommen. Wenn sie zu klein ist, kann das Stapeln von Zellen die Nadel verstopfen und den Transplantationsprozess behindern. Die Transplantation sollte innerhalb von 1 Stunde abgeschlossen sein, um das Leiden und den Tod der Zellen zu minimieren.
Das vorgeschlagene Protokoll bietet ein optimales und vielseitiges Werkzeug für verschiedene Arten von Untersuchungen. Hier setzen wir unsere Langzeitplattform ein, um die Transplantation von h-SC-NES-Zellen in den ersten Stadien der Differenzierung in SC-Gewebe der Maus für 30 Tage zu validieren. Die wichtigste Neuerung des vorgeschlagenen Ansatzes ist die Optimierung des Co-Kulturprotokolls. Die Bestandteile von GM sorgen für das langfristige neuronale Überleben der SC-Schnitte und der transplantierten h-SC-NES-Zellen. In der Tat erhält GM, da es sich um ein serumfreies Medium handelt, die Differenzierung der transplantierten Zellen in Bezug auf das neuronale Schicksal im Vergleich zu dem Medium, das zuvor für die organotypische Schnittkultur verwendet wurde,aufrecht 47.
Was die vorgeschlagenen Modelle für die Querschnittlähmung betrifft, so werden die Experimente in der Regel an erwachsenen Mäusen durchgeführt. Bisher hängen die wichtigsten Unterschiede zwischen neonatalen und adulten subkutanen Mäusen mit dem höheren Regenerationspotenzial zusammen, das bei neonatalen Mäusen im Vergleich zu adulten Mäusen gefunden wurde52. Solche Unterschiede haben jedoch keinen Einfluss auf die Art des Protokolls, das wir vorschlagen, da wir uns hier auf die Reaktion transplantierter Zellen auf die Umgebung des Wirtsgewebes konzentrieren und nicht auf die Regenerationsfähigkeiten der ansässigen Neuronen. Ein weiterer Unterschied zwischen neonatalen und adulten Mäusen nach einer Querschnittlähmung hängt mit der Bildung der Glianarbe zusammen, die bei Erwachsenen auftritt. Dieser Aspekt wird in dem vorgeschlagenen Modell nicht berücksichtigt, das die komplexen physiopathologischen Prozesse, die sich aus primären und sekundären Verletzungen ergeben, nicht berücksichtigt.
Was die Anwendungen betrifft, so könnte die Plattform auch genutzt werden, um die Integration zwischen den transplantierten Zellen und den residenten Schaltkreisen zu untersuchen, die im organotypischen SC-Modell vorhanden sind. Gentechnische Werkzeuge wurden bereits im ZNS zur Bewertung der synaptischen Konnektivität eingesetzt und könnten in dieser Hinsicht genutzt werden 53,54,55. Insbesondere konnte die Integration untersucht und validiert werden, indem die Bildung von Synapsen zwischen den transplantierten Zellen und dem SC ex vivo Gewebe untersucht und validiert wurde. Diese organotypischen Langzeitkulturen könnten auch zur Erprobung neuroprotektiver und neuroregenerativer Wirkstoffe oder neuartiger Moleküle/Materialien oder zur Untersuchung neurodegenerativer Erkrankungen, an denen der SC beteiligt ist, genutzt werden. Um spezifische neurodegenerative Erkrankungen zu untersuchen, muss das Protokoll für die Kultivierung von SC-Schnitten angepasst werden, die aus relevanten Modellen generiert wurden, wie z. B. transgenen Mäusen mit spezifischen pathologieassoziierten Mutationen, in dem für die Pathologie relevanten Stadium (d. h. Neugeborene, Jungtiere, Erwachsene). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unser Protokoll und unsere organotypischen Kulturen im Allgemeinen, da es sich um Explantate eines bestimmten Organs handelt, Merkmale aufweisen, die die Lücke zwischen 2D-Zellkulturen und In-vivo-Modellen schließen und sie als unschätzbares Werkzeug sowohl für die Grundlagenforschung als auch für präklinische Tests bestätigen.

Eine traumatische Rückenmarksverletzung (SCI) hat verheerende physische, psychische und wirtschaftliche Folgen für Patienten und Betreuer1. Es wurden viele Versuche unternommen, die axonale Regeneration bei Querschnittlähmung mit unterschiedlichen Ansätzen zu fördern 2,3,4 und einige vorteilhafte Effekte wurden durch die Bildung von neuronalen Relais zwischen proximalen und distalen Neuronen in der Verletzungsstelle durch Zellersatztherapien gezeigt. Das Interesse an Zelltherapien wächst weiter5, da transplantierte Zellen viele Rollen spielen können, darunter trophische Unterstützung, Immunmodulation, Regeneration verlorener neuronaler Schaltkreise durch Induktion von Plastizität, Zellersatz und Axonremyelinisierung6.
In jüngster Zeit konzentrierten sich die Hauptbemühungen auf menschliche neurale Stamm-/Vorläuferzellen (NSCs/NPCs)7. Mehrere Studien deuten darauf hin, dass NSCs/NPCs die Astrozytenantwort modulieren8, die Sekretion von proregenerativen Faktorenfördern 9,10 und fehlende neuronale Zellen bei Querschnittlähmung ersetzen11,12. Studien, die die Differenzierung von transplantierten Zellen in funktionsfähige Neuronen unterstützen, sind jedoch noch dürftig. Darüber hinaus sind das Überleben und die Differenzierung transplantierter Zellen im verletzten Rückenmark (SC) gering13, möglicherweise weil transplantierte Zellen mehrere Wochen oder sogar Monate benötigen, um sich in vivo zu differenzieren. Darüber hinaus haben aktuelle Studien viele biochemische, molekulare, zelluläre und funktionelle Aspekte von Zellersatztherapien nicht vollständig aufgeklärt. In diesem Zusammenhang sind einfache, schnelle und kostengünstige Modelle erforderlich, um die Mechanismen der Zelltransplantation zu untersuchen, die Fähigkeit transplantierter Zellen, sich zu vermehren, sich in bestimmte Zelltypen oder Subpopulationen zu differenzieren und Synapsen mit ansässigen Neuronen zu bilden.
Die Integration histologischer Untersuchungen in die elektrophysiologische Aufzeichnung und das Transkriptom- und Proteom-Profiling ist notwendig, um die molekulare Kaskade, die nach einer Zelltransplantation auftritt, vollständig zu verstehen. Dies wird sicherlich das Design und die Validierung neuer Zellersatztherapien in präklinischen Modellen und klinischen Studien beschleunigen. Tatsächlich hat sich der Einsatz von Nagetieren, Großtieren und nichtmenschlichen Primaten bisher gelohnt, um viele zelluläre Prozesse nach der Transplantation aufzuklären14. Aufgrund der hohen Kosten, der hohen ethischen Auswirkungen sowie der Komplexität des Organismus ist ihre Anwendung jedoch oft nicht einfach oder nicht ausreichend, um biochemische und molekulare Prozesse zu entschlüsseln. Darüber hinaus können sie viele Nachteile aufweisen, die mit biologischen Unterschieden korrelieren, sowohl zwischen den Arten (Stoffwechsel) als auch innerhalb der Arten (Geschlecht, Alter).  Diese Faktoren, zusammen mit externen Faktoren wie Stresssituationen, könnten das Ergebnis eines Experiments und ihre Vorhersagbarkeit im Hinblick auf die therapeutische Umsetzung auf den Menschen verändern 15,16,17.
Daher verwenden viele Gruppen neben Tiermodellen auch 2D-in-vitro-Zellkulturen und ex vivo organotypische Schnitte (ex vivo-Kulturen). Die 2D-Zellkultur ist das am häufigsten verwendete System zur Untersuchung spezifischer biologischer Prozesse auf Einzelzell- und/oder Zellpopulationsebene. Dennoch spiegeln Monolayer-Zellkulturen nicht die Komplexität wider, die in einem ganzen Organismus zu finden ist. Das Fehlen von Gewebestrukturen und physiologischer Umgebung erlaubt es den 2D-Kultursystemen nicht, wichtige strukturelle, morphologische und funktionelle Aspekte des untersuchten Gewebes vollständig zu emulieren 18,19,20.Organotypische Kulturen können einige dieser Probleme überwinden. Organotypische Modelle basieren auf der Explantation eines Fragments eines Gewebes oder Organs und dessen Ex-vivo-Konservierung für einen begrenzten Zeitraum 21,22. Insbesondere werden Scheiben des explantierten Gewebes mit einer präzisen Dicke erzeugt, die es ermöglicht, dass die Nährstoffe fast alle Zellen in den Scheiben leicht erreichen können. Sie können aus verschiedenen Regionen des Zentralnervensystems gebildet werden, wie z. B. dem Hippocampus, dem Hypothalamus, dem Kleinhirn, dem Thalamus, der Großhirnrinde, der Substantia nigra und dem Striatum sowie dem Rückenmark23. Organotypische Kulturen bewahren die Gewebearchitektur, die räumliche Verteilung der Zellen, die zelluläre Vielfalt und die Umgebung (d.h. die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix) des Ursprungsorgans. Darüber hinaus bewahren sie die ursprüngliche neuronale Aktivität, die Verbindungen zwischen den Zellen und insbesondere die Kurzstreckenschaltkreise nach der Explantation.
Diese Aspekte bieten einige Vorteile für ex vivo-Kulturen sowohl in Bezug auf Monolayer-Kulturen als auch auf Tiermodelle. Sie behalten wichtige Gewebemerkmale bei, die in vivo gefunden werden, jedoch mit einer Reduzierung der Kosten und der Möglichkeit, verschiedene Arten von molekularen, zellulären und funktionellen Experimenten mit einer genauen Regulierung der Umweltparameter der Kultur durchzuführen 24,25,26,27,28,29. Organotypische Schnitte können auch genutzt werden, um Modelle für verschiedene neurologische Erkrankungen zu entwickeln, indem sie wichtigen histopathologischen Merkmalen bestimmter Erkrankungen ähneln30. Darüber hinaus sind sie durch die Beibehaltung der ursprünglichen multizellulären Gewebeumgebung geeignete Plattformen für das Wirkstoffscreening und für die Erprobung neuroprotektiver und neuroregenerativer Moleküle und Materialien.
In dieser Arbeit schlagen wir die Verwendung von organotypischen SC-Kulturen als Modell zur Optimierung von NSC-Transplantationen vor. Dies ist nicht trivial, da optimale Kultivierungsbedingungen erforderlich sind, um das Überleben sowohl des Wirts (SC-Gewebe) als auch des Transplantats (NSCs) über Wochen zu gewährleisten. Verschiedene Forschungsgruppen transplantierten in organotypische Kulturen, aus dem Gehirn und aus SC, verschiedene Zelltypen. Die meisten Arbeiten zeigten die Transplantation von mesenchymalen Stammzellen 31,32,33, olfaktorischen Hüllzellen34 oder NSCs 35,36,37,38,39,40 und bewerteten die Wechselwirkungen der transplantierten Zellen mit den Wirtszellen, das Überleben des gesamten Systems und ob sich die transplantierten Zellen in Neuronen oder neuronenähnliche Zellen differenzierten in der ex vivo Gewebeumgebung 32,33,41. Einige von ihnen untersuchten das regenerative Potenzial von Zellen nach der Transplantation, indem sie ihr axonales Wachstum im Gewebebeobachteten 37,40,41, die myelinisierende Fähigkeit von transplantierten Vorläufern von Oligodendrozyten42, die Migration transplantierter Zellen in das Wirtsgewebe43 und ob die transplantierten Zellen Faktoren freisetzten, die in Richtung einer proregenerativen Umgebung drängen31. Eine Einschränkung der aktuellen Studien besteht darin, dass sie die Transplantation nicht über einen längeren Zeitraum untersuchen.
In Anbetracht der Tatsache, dass NSCs anscheinend mehrere Wochen benötigen, um in vivo zu differenzieren 44,45, konzentriert sich diese Studie auf die Generierung und Aufrechterhaltung langfristiger (≥30 Tage) Maus-SC-Schnitte für bis zu 90 Tage. Es wurde festgestellt, dass die Schnitte ihre ursprüngliche anatomische Struktur beibehalten und über die Zeit eine niedrige und stabile apoptotische Rate sowie eine hohe Zellviabilität aufweisen. Wir beobachteten eine diffuse Expression der neuronalen Marker RNA-binding fox-1 homolog 3 (RBFOX3) und neurofilament light chain (NFL), wobei letztere im Laufe der Zeit einen zunehmenden Trend der axonalen Keimung um die Schnitte zeigten, was ihren gesunden Zustand bestätigt. Darüber hinaus haben wir in den ersten Stadien der neuronalen Differenzierung erfolgreich GFP-exprimierende humane SC-abgeleitete neuroepitheliale Stammzellen (h-SC-NES) in die SC-Schnitte transplantiert. Das NSC-Transplantat wurde 30 Tage nach der Transplantation aufbewahrt und die Zellen zeigten während des gesamten Kulturzeitraums eine GFP-Expression. Es wurde auch festgestellt, dass die apoptotische Rate der Zellen am Tag nach der Transplantation (DPT) 30 in Bezug auf den apoptotischen Ratenwert übereinstimmte, der bei DPT 7 in denselben Zellenbeobachtet wurde 40. Die Zellen schienen sich in die Gewebeumgebung einzunisten und überlebten bis zu mehreren Wochen.
Zusammenfassend zeigen unsere Daten, dass es möglich ist, organotypische Scheiben in Kultur für 3 Monate zu erhalten, ohne ihre ursprüngliche Zytoarchitektur und das Gewebemilieu zu beeinträchtigen. Am wichtigsten ist, dass sie genutzt werden können, um Zelltherapien zu testen, bevor mit einem In-vivo-Experiment fortgefahren wird, wodurch die Kosten und die Versuchszeit reduziert werden. Im Folgenden veranschaulichen wir im Detail alle Passagen zur Generierung von organotypischen Slices für Maus-SC und wie sie über einen längeren Zeitraum (≥30 Tage) aufrechterhalten werden können. Darüber hinaus erklären wir ausführlich, wie eine NPC-Transplantation in die Schichten durchgeführt und wie sie für die nachgelagerte Analyse aufbewahrt werden.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-cleaved Caspase-3,&#160; (Asp175) (5A1E) (Rabbit)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9661S</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP (Mouse) - monoclonal</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>G6539</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Human Nuclei (Mouse) - monoclonal, clone 235-1&#160;</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>MAB1281</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Human Nuclei (Rabbit)</td>
			<td>NeoBiotechnologies</td>
			<td>RBM5-346-P1</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NeuN (RBFOX3) (Rabbit) - polyclonal</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>ABN78</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NFL (Mouse)</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>MAB1615</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NFL H-Phospho (Rabbit) -polyclonal</td>
			<td>Biologend</td>
			<td>840801</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Polymount</td>
			<td>Poly-sciences</td>
			<td>18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC7074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>118364227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture graded water</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>W3500-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from rat tail</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>C7661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope - A1 Confocal Microscope (Eclipse Ti)</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>gf144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-2</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>03-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>SRP3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries, 3.5&#34;&#160;</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti Mouse IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti Mouse IgG Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21236</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti Rabbit IgG Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11011</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti Rabbit IgG Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21244</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph Pad-Prism</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td></td>
			<td>Software for Statistical Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-050</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral prep</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>17446-LV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L32250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11090-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>to load cells in the needle for transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell cell culture membrane</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscroscope cover glasses</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>ECN 631-1572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (35mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pasteur pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1171.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV830</td>
			<td>Microinjector for transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>SWAN3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle #3</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope for imaging and acquisition</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope for surgery</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers-Dumont #5-inox</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Scissors, 8.5 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical micropipette puller</td>
			<td>Shutter Instrument</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254/50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term mouse spinal cord organotypic slice culture as a platform for validating cell transplantation in spinal cord injury

Lösende Heilmittel für Rückenmarksverletzungen (SCI) fehlen aufgrund der komplexen Pathophysiologie immer noch. Einer der vielversprechendsten regenerativen Ansätze basiert auf der Stammzelltransplantation, um verlorenes Gewebe zu ersetzen und die funktionelle Wiederherstellung zu fördern. Dieser Ansatz sollte im Hinblick auf Sicherheit und Wirksamkeit in vitro und ex vivo weiter untersucht werden, bevor mit teureren und zeitaufwändigeren Tierversuchen fortgefahren wird. In dieser Arbeit zeigen wir die Etablierung einer Langzeitplattform auf der Grundlage von organotypischen Schnitten des Rückenmarks der Maus, die mit humanen neuralen Stammzellen transplantiert wurden, um zelluläre Ersatztherapien für Querschnittlähmungen zu testen.
Organotypische Standardkulturen des SC werden in vitro etwa 2 bis 3 Wochen lang aufbewahrt. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll für die Langzeitwartung (≥30 Tage) für bis zu 90 Tage. Das Medium, das für die Langzeitkultivierung von SC-Schnitten verwendet wird, wurde auch für die Transplantation von neuralen Stammzellen in das organotypische Modell optimiert. Humane SC-abgeleitete neuroepitheliale Stammzellen (h-SC-NES), die einen grün fluoreszierenden Protein-Reporter (GFP) tragen, wurden in SC-Schnitte von Mäusen transplantiert. Dreißig Tage nach der Transplantation zeigen die Zellen immer noch eine GFP-Expression und eine niedrige apoptotische Rate, was darauf hindeutet, dass die optimierte Umgebung ihr Überleben und ihre Integration in das Gewebe aufrechterhielt. Dieses Protokoll stellt eine robuste Referenz für die effiziente Erprobung von Zellersatztherapien im SC-Gewebe dar. Diese Plattform wird es Forschern ermöglichen, ein Ex-vivo-Vorscreening verschiedener Zelltransplantationstherapien durchzuführen und ihnen dabei zu helfen, die am besten geeignete Strategie zu wählen, bevor sie mit In-vivo-Experimenten fortfahren.

Traumatic spinal cord injury (SCI) has devastating physical, psychological, and economic consequences for patients and caregivers1. Many attempts have been made to promote axonal regeneration in SCI with different approaches2,3,4 and some beneficial effects were demonstrated by the formation of neuronal relays between proximal and distal neurons in the injury site through cell replacement therapies. The interest in cell therapies is still growing5 since transplanted cells can play many roles, including providing trophic support, immune modulation, regenerating lost neural circuits through induction of plasticity, cell replacement, and axon remyelination6.
Recently, the main effort in the field focused on human neural stem/progenitor cells (NSCs/NPCs)7. Several studies suggest that NSCs/NPCs modulate astrocyte response8, promote the secretion of proregenerative factors9,10, and replace missing neuronal cells in SCI11,12. However, studies that support the differentiation of transplanted cells into functional neurons are still poor. Moreover, transplanted cell survival and differentiation in the injured spinal cord (SC) are low13, possibly because transplanted cells take several weeks, even months, to differentiate in vivo. Additionally, current studies have not completely elucidated many biochemical, molecular, cellular, and functional aspects of cell replacement therapies. In this context, simple, fast, and cost-effective models are required to study the mechanisms of cell engraftment, the ability of engrafted cells to proliferate, differentiate into specific types or subpopulations of cells, and form synapses with resident neurons.
Integrating histological studies into electrophysiological recording and transcriptome and proteome profiling is necessary for a full comprehension of the molecular cascade occurring after cell transplantation. This certainly will speed up the design and validation of new cell replacement therapies in preclinical models and clinical studies. Indeed, to date, the use of rodents, large animals, and non-human primates has been worthwhile for elucidating many cellular processes after transplantation14. However, due to the high cost, the high ethical impact, as well as the complexity of the organism, their use is often not straightforward or not adequate to unravel biochemical and molecular processes. In addition, they may present many disadvantages correlated with biological differences, both interspecies (metabolism) and intraspecies variability (sex, age).&#160;&#160;These factors, together with external factors such as stressful situations, could alter the outcome of an experiment and their predictability in terms of therapeutic translation to humans15,16,17.
Thus, many groups employ 2D in vitro cell culture and ex vivo organotypic slices (ex vivo cultures) in addition to animal models. 2D cell culture is the most commonly used system for studying specific biological processes at a single-cell and/or cell population level. Nevertheless, monolayer cell cultures do not reflect the complexity found in a whole organism. The lack of tissue structures and&#160;physiological environment does not allow the 2D culture systems to completely emulate key structural, morphological, and functional aspects of the investigated tissue18,19,20. Organotypic cultures can overcome some of these issues. Organotypic models are based on explanting a fragment of a tissue or organ and maintaining it ex vivo for a limited period21,22. In particular, slices of the explanted tissue are generated with a precise thickness that allows nutrients to easily reach almost all the cells in the slices. They&#160;can be generated from various regions of the central nervous system, such as the hippocampus, hypothalamus, cerebellum, thalamus, cerebral cortex, substantia nigra and striatum, and spinal cord23. Organotypic cultures retain the tissue architecture, the spatial distribution of cells, the cellular diversity, and the environment (i.e., extracellular matrix composition) of the organ of origin. Moreover, they preserve the original neural activity, connections between cells, and in particular, short-distance circuits after the explant.
These aspects provide some advantages for ex vivo cultures with respect to both monolayer cultures and animal models. They retain key tissue features found in vivo but with the reduction of the costs and the possibility to perform different types of molecular, cellular, and functional experiments with an accurate regulation of the culture environmental parameters24,25,26,27,28,29. Organotypic slices can also be exploited to develop models for different neurological disorders by resembling key histopathological features of specific conditions30. Moreover, the retention of the original multicellular tissue environment renders them appropriate platforms for drug screening and for testing neuroprotective and neuro-regenerative molecules and materials.
In this work, we propose the use of SC organotypic cultures as a model to optimize NSC transplants. This is not trivial since optimal culturing conditions are required to guarantee the survival of both the host (SC tissue) and the transplant (NSCs) for weeks. Different research groups engrafted in organotypic cultures, brain-derived and SC-derived, various types of cells. Most of the works showed the transplantation of mesenchymal stem cells31,32,33, olfactory ensheathing cells34, or NSCs35,36,37,38,39,40 and evaluated the interactions of engrafted cells with the host cells, the survival of the whole system, and whether the transplanted cells differentiated into neurons or neuron-like cells inside the ex vivo tissue environment32,33,41. Some of them evaluated the regenerative potential of cells after transplant, observing their axonal growth inside the tissue37,40,41, the myelinating ability of engrafted precursors of oligodendrocytes42, the migration of engrafted cells into the host tissue43, and whether the transplanted cells released factors pushing towards a proregenerative environment31. One limitation of the current studies is that they do not explore the engraftment for a long-term period.
Considering that NSCs seem to require several weeks to differentiate in vivo44,45, this study focuses on how to generate and maintain long-term (&#8805;30 days) mouse SC slices for up to 90 days. Slices were found to retain their original anatomical structure and to maintain a low and stable apoptotic rate over time and high cell viability. We observed diffuse expression of neuronal markers RNA binding fox-1 homolog 3 (RBFOX3) and neurofilament light chain (NFL), with the latter showing an increasing trend of axonal sprouting around the slices over time, attesting to their healthy condition. Moreover, we successfully transplanted into the SC-slices GFP-expressing human SC-derived neuroepithelial stem (h-SC-NES) cells at the first stages of neuronal differentiation. The NSC graft was maintained for 30 days after transplant and cells showed GFP expression for all the period in culture. The apoptotic rate of cells at day post-transplant (DPT) 30 was also found to be in line with respect to the apoptotic rate value observed at DPT 7 in the same cells40. Cells seemed to engraft into the tissue environment and survived up to several weeks.
In summary, our data demonstrate that it is possible to maintain in culture SC organotypic slices for 3 months without compromising their original cytoarchitecture and the tissue environment. Most importantly, they can be exploited to test cell therapies before proceeding with an in vivo experiment, thus reducing the costs and the experimental time. Here, we illustrate in detail all the passages to generate mouse SC organotypic slices and how to maintain them for long-term periods (&#8805;30 days). Moreover, we deeply explain how to perform NPC transplantation into the slices and how to maintain them for downstream analysis.

Autor im Rampenlicht: Langfristige Kultur von Rückenmarksschnitten zur Weiterentwicklung von Regenerationstherapien des Rückenmarks

Organotypische Schnittkultur des Rückenmarks der Maus als Plattform zur Validierung der Zelltransplantation bei Rückenmarksverletzungen

We are interested in developing a promising regenerative approach to address spinal cord injuries. In this paper, we validate spinal cord organotypic model for testing cellular replacement therapies in spinal cord research. So far, spinal cord organotypic models are maintained in culture for two or three weeks in vitro.And subculture media are suboptimal for neural stem cell engraftment, differentiation, and maturation. Cell replacement therapies still require the improvement to announce the ability of the grafted cells to reconstitute the lost circuits. Through this protocol, we provide a novel, long-term ex vivo platform to tackle cell transplant related issue like survival, integration, and maturation rate of the engrafted neural stem cells.This platform will be helpful for researchers to find the best strategy for cell transplantation, reducing the number of animals required for in vivo validation. Our protocol is simple, fast, and cost-effective to perform proof of concept and optimization studies.

Die beschriebenen Methoden ermöglichen die Etablierung von subkutanen organotypischen Schnitten von Mäusen im Stadium P3 und deren Konservierung in Kultur über einen längeren Zeitraum unter gesunden Bedingungen. Darüber hinaus zeigen wir ein Protokoll für die Transplantation von Zellen in die Scheiben und für deren Co-Kultivierung für bis zu 30 Tage (Abbildung 1). Zunächst zeigen wir die Optimierung der Kulturbedingungen und ein Protokoll, das für eine längere Kultivierung der SC-Schnitte mit transplantierten Zellen geeignet ist (Abbildung 2A). Slices werden von DEV 0 bis DEV 2 im OM erzeugt und gepflegt, das ursprünglich als optimales Medium für die Pflege der SC-Slices47 vorgeschlagen wurde. Aufgrund des Vorhandenseins von Serumproteinen könnte dieses Medium jedoch suboptimal sein, um die neuronale Differenzierung und Reifung der transplantierten neuralen Vorläuferzellen aufrechtzuerhalten. In der Tat testeten wir bei DEV 3 den Wechsel von OM zu GM, einer Formulierung, die Neurobasal plus B27 enthält, das das neuronale Überleben unterstützt, und ohne Serum, das die korrekte neuronale Differenzierung hemmt und stattdessen ein gliales Schicksal fördert48,49.
Abbildung 2B zeigt die Ergebnisse, die durch das Umschalten des Mediums bei DEV 3 von OM auf GM erzielt wurden, verglichen mit den SC-Schnitten, die den Wechsel nicht erhielten (die Kontrollschnitten wurden in OM kultiviert). Wir nutzten die Verteilung des NFL-Signals innerhalb der Schichten als Marker für die neuronale Integrität (Abbildung 2B,C). Die Schnitte bei DEV 7 waren unter beiden Kultivierungsbedingungen gesund, was die diffuse Verteilung von Neurofilament (NFL, in grün) in ihnen zeigt. Bei DEV 10 schienen in GM kultivierte Scheiben im Vergleich zu den in OM kultivierten Kontrollscheiben gesünder zu sein, wie durch die NFL-Färbeverteilung dokumentiert wurde. Wir haben auch die NFL+-Fläche (% NFL+-Fläche/DAPI+-Fläche) der Schichten geschätzt, die in den repräsentativen Bildern in Abbildung 2B gezeigt sind. Die geschätzte NFL+-Fläche ist in den Histogrammen in Abbildung 2C dargestellt, was bestätigt, dass das NFL-Signal unter beiden Bedingungen diffus in den Schichten bei DEV 7 verteilt ist. Bei DEV 10 nimmt jedoch die geschätzte Fläche, die von der NFL-Färbung bedeckt ist, für die OM-Kultivierungsbedingung ab.
Diese Daten deuten darauf hin, dass die Umstellung auf den GM bei DEV 3 für eine längere Kultivierung von SC-Scheiben (DEV 10) gut vertragen wird. Als nächsten Schritt haben wir GM zu längeren Zeitpunkten getestet: DEV 30, DEV 60 und DEV 90. Wie in Abbildung 3A,B gezeigt, wurden die Scheiben in Kultur bis DEV 90 gesund gehalten. NFL-Färbungen wurden in den Schichten zu jedem Zeitpunkt weit verbreitet gefunden, wobei diffuse Sprossen um die Neuritenscheiben herum sprießen, die von der zentralen Region ausgehen. Tatsächlich haben wir die NFL+-Fläche der in Abbildung 3A gezeigten Schichten geschätzt und sie hat sich im Laufe der Zeit vergrößert, wie in den Histogrammen von Abbildung 3B gezeigt. Wir beobachteten auch eine Positivität des neuronalen Markers RBFOX3, was einen weiteren Beweis für die neuronale Differenzierung der Schichten liefert. Zu jedem Zeitpunkt überprüften wir auch die Apoptoserate, indem wir in verschiedenen Schichten die Anzahl der Zellen auswerteten, die positiv für aCASP3 waren (Abbildung 4A,B). Die Analyse wurde wie in Protokollabschnitt 10.2 beschrieben durchgeführt. Es wurde festgestellt, dass die Apoptoserate (% aCASP3+-Zellen/Gesamtzahl der DAPI+-Zellen) zu jedem Zeitpunkt sehr niedrig war (0,85 ± 0,52 %, 0,71 ± 0,27 %, 0,66 ± 0,45 % für DEV 30, 60 bzw. 90) ohne signifikante Unterschiede zwischen den drei betrachteten Zeitpunkten (p-Wert > 0,05, Abbildung 4B). Diese Daten deuten darauf hin, dass die mit aCASP3 assoziierte apoptotische Rate über die Zeit stabil bleibt und zusammen mit der breiten Verteilung von NFL in den Schichten (Abbildung 4A) das Überleben der Schichten zu jedem Zeitpunkt bestätigt.
Zur Unterstützung früherer Daten führten wir auch einen Lebend-/Tot-Assay durch, um die Lebensfähigkeit der Scheiben zu den drei verschiedenen Zeitpunkten zu bewerten. Wir verwendeten Calcein (grüne Färbung), um die lebensfähigen und metabolisch aktiven Zellen zu markieren, und Sytox (Cyan-Färbung), um den Zelltod zu beurteilen. Wie in den Histogrammen in Abbildung 4C gezeigt, steigt der Prozentsatz der metabolisch aktiven Zellen von DEV 30 auf DEV 90 leicht an (93,17 ± 5,21 %, 96,43 ± 3,02 %, 96,33 ± 3,10 % für DEV 30, 60 bzw. 90) und stabilisiert sich zwischen den letzten beiden Zeitpunkten (DEV 30 vs. DEV 60 p-Wert = 0,018; DEV 30 vs. DEV 90 p-Wert = 0,027; DEV 60 vs. DEV 90 p-Wert = 0,99). Wir fanden einen niedrigen Zelltod, der im Laufe der Zeit abnahm (6,83 ± 5,21 %, 3,57 ± 3,02 %, 3,66 ± 3,10 % für DEV 30, 60 bzw. 90), und es wurde ein signifikanter Unterschied zwischen DEV 30 und späteren Zeitpunkten, DEV 60 und DEV 90, festgestellt (DEV 30 vs. DEV 60 p-Wert = 0,018; DEV 30 vs. DEV 90 p-Wert = 0,027; DEV 60 vs. DEV 90 p-Wert = 0,99). Diese Daten bestätigen in Verbindung mit der Apoptoserate das Überleben der Scheibe im Laufe der Zeit und unterstützen die Wirksamkeit des durchgeführten Langzeitkultivierungsprotokolls.
Nachdem die Machbarkeit einer längeren Kultivierung der SC-Schnitte festgestellt wurde, forderten wir das System durch die Transplantation von h-SC-NES-Zellen in den ersten Stadien der neuronalen Differenzierung heraus. Wir haben die h-SC-NES-Zellen getestet, da sie vielversprechende Ergebnisse für die Behandlung von Rückenmarksverletzungen gezeigt haben12. Das Transplantationsverfahren von h-SC-NES-Zellen in die SC-Schnitte der Maus ist in Protokollabschnitt 6 beschrieben. Die SC-Schnitte und transplantierten h-SC-NES-Zellen wurden bis DPT 30 aufbewahrt. Die Zellen wurden bei DIV 10 der Differenzierung (neuronales Vorläuferstadium) in organotypische Scheiben von DEV 4 transplantiert, wie im Protokollschema in Abbildung 5A gezeigt. Transplantierte Zellen wurden bis zu 30 Tage lang auf die Expression von GFP in Kultur überwacht. Abbildung 5B zeigt repräsentative Live-Bilder eines SC-Schnitts mit transplantierten GFP+ -Zellen bei unterschiedlichen DPT. Die stabile Expression von GFP über die Zeit (Abbildung 5B und Abbildung 6A) deutet darauf hin, dass die Zellen unter den zuvor optimierten Kulturbedingungen in das SC-Gewebe überlebten. Wir überprüften auch die apoptotische Rate der transplantierten Zellen, wie in Protokollabschnitt 10.2 beschrieben. Die apoptotische Rate (% aCASP3+ -Zellen/Gesamtzahl der Hu-Nu+ -Zellen) erwies sich nach 30 DPT als sehr niedrig (0,44 ± 0,34%) (Abbildung 6B). Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die apoptotische Rate bei DPT 30 mit der für denselben Zelltyp bei DPT 7 übereinstimmte, wie zuvor berichtet40, was dokumentiert, dass sich die Kulturen im Laufe der Zeit stabilisieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig01.jpg"> Abbildung 1: Ablauf des Protokolls. Repräsentatives Schema, das den allgemeinen Arbeitsablauf des durchgeführten Protokolls zeigt. (A) Auf der linken Seite ein Schema, das die Erzeugung von Maus-SC-Scheiben aus isolierten SC von Maus-Jungtieren an P3 und die Langzeitkultivierung von SC-organotypischen Schnitten zusammenfasst. (B) Auf der rechten Seite ein Schema, das die Transplantation von h-SC-NES-Zellen, die GFP exprimieren, in SC-organotypische Mausschnitte zusammenfasst. Die transplantierten Zellen werden 30 Tage nach der Transplantation aufbewahrt. Abkürzungen: h-SC-NES = human spinal cord-derived neuroepithelial stem; GFP = grün fluoreszierendes Protein; DEV = Tag ex vivo; DPT = Tag nach der Transplantation; NFL = Neurofilament-Leichtkette; RBFOX3= RNA-Bindung Fox-1 Homolog 3; aCASP3 = aktive Caspase-3; SC = Rückenmark. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig02v2.jpg"> Abbildung 2: Optimierung der Langzeit-Kultivierungsbedingungen. (A) Repräsentatives Schema des Protokolls für die Prüfung von OM und GM. OM wird für die Kontrollgruppe bis DEV 7-10 beibehalten. Das Medium wird bei DEV 3 für die behandelten Scheiben auf den GM umgeschaltet; dann werden sie zum Vergleich mit den Steuerungen auf DEV 7-10 fixiert. (B) Repräsentative Bilder zum Vergleich von organotypischen Schnitten von Maus-SC bei DEV 7 und 10, die unter verschiedenen Bedingungen kultiviert wurden. Die Scheiben werden auf den Zytoskelettmarker Neurofilament (NFL, grün) gefärbt. Die weite Verbreitung der NFL-Färbung in Scheiben, die mit GM kultiviert wurden, deutet auf ein Gesamtüberleben und eine Differenzierung hin. Die Zellkerne werden mit DAPI gegengefärbt. Maßstabsbalken = 500 μm. (C) Repräsentative Histogramme der Schätzung des von NFL abgedeckten Gebiets in den in Abbildung 1B gezeigten Schichten. Bei DEV 10 nimmt die NFL-Oberfläche im OM-Kultivierungszustand ab. Abkürzungen: DEV = Tag ex vivo; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; NFL = Neurofilament-Leichtkette.; OM = organotypisches Medium; GM = Transplantatmedium; SC = Rückenmark. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig03v3.jpg"> Abbildung 3: Organotypische Scheiben aus dem Langzeitkulturell von Mausen. (A) Die Scheiben werden bis DEV 90 in Kultur gehalten. Der Immunfluoreszenz-Assay zeigt eine weite Verteilung des Zytoskelettmarkers Neurofilament (NFL, grün) und des nukleären neuronalen Markers RBFOX3 (rot), was ihren gesunden Zustand und ihre neuronale Identität nach Langzeitkultivierung bescheinigt. Bemerkenswert ist, dass NFL+ -Axone im Laufe der Zeit diffus um die Scheiben herum sprießen. Die Zellkerne werden mit DAPI gegengefärbt. Maßstabsbalken = 500 μm. (B) Repräsentative Histogramme der Schätzung der NFL+ -Fläche und -Zeit sowie der RBFOX3+ -Fläche der in Feld A gezeigten Schichten . Der NFL+ -Neuritenbereich nimmt mit der Zeit zu. Abkürzungen: DEV = Tag ex vivo; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; NFL = Neurofilament-Leichtkette; SC = Rückenmark; RBFOX3= RNA-bindendes Fox-1-Homolog 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig04.jpg"> Abbildung 4: Bewertung der Zellviabilität in den SC-Schnitten über die Zeit. (A) Repräsentative Bilder von organotypischen Schnitten bei DEV 60, gefärbt für aCASP3 (rot) und NFL (grün). Maßstabsleiste = 100 μm. NFL zeigt ein diffuses Muster. Seltene Zellen sind positiv für den apoptotischen Marker aCASP3 (Einschübe: 1-2-3). (B) Analyse der Apoptoserate in Schichten zu verschiedenen Zeitpunkten. Mittelwert ± SD, N (repliziert) = 6 Schichten, n (Gesamtzellen) > 1.000 für jede Schicht, Kruskal-Wallis-Test, Mehrfachvergleich, p-Wert > 0,05. Die apoptotische Rate ist über die Zeit stabil. In den Einschüben 1-2-3 von Panel A ist es möglich, Details von Zellen zu beobachten, die positiv für aCASP3 sind (rote Färbung, weiße Pfeile). Kleine rote Punkte markieren Zelltrümmer und pyknotische Zellkerne. Maßstabsbalken = 50 μm. (C) Repräsentative Bilder von Lebend-/Tot-Assays, die an SC-Schnitten bei DEV 90 durchgeführt wurden: Stoffwechselaktive Zellen werden mit Calcein grün markiert, während tote und geschädigte Zellen mit Sytox in Hellblau (Cyan) markiert sind. Die beiden Histogramme zeigen den prozentualen Anteil der Zellen, die positiv für Calcein (links) und Sytox (rechts) sind, bezogen auf die Gesamtzahl der Zellen. Für beide mittleren ± SD ist N (repliziert) = 6 Schichten, n (Gesamtzellen) > 1.000 für jede Schicht, Kruskal-Wallis-Test, Mehrfachvergleich, DEV 30 vs. DEV 60 p-Wert = 0,018; DEV 30 vs. DEV 90 p-Wert = 0,027; DEV 60 vs DEV 90 p-Wert > 0.99. Abkürzungen: DEV = Tag ex vivo; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; NFL = Neurofilament-Leichtkette; SC = Rückenmark; aCASP3 = aktive Caspase-3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig05.jpg"> Abbildung 5: h-SC-NES-Zelltransplantation in organotypische Mausschnitte. (A) Repräsentatives Schema des Transplantationsprotokolls. Zellen werden als neuronale Vorläufer bei DIV 10 der Differenzierung in organotypische DEV-4-Schnitte transplantiert. (B) Repräsentative Bilder von organotypischen Mausschnitten, die im Laufe der Zeit bis DPT 30 mit GFP-exprimierenden h-SC-NES-Zellen transplantiert wurden. Die Zellen werden mit einem lentiviralen Vektor transduziert, der das GFP-Gen trägt. Die GFP-Expression im Laufe der Zeit bestätigt ihre Lebensfähigkeit und Anpassung an die Schnittumgebung. Maßstabsleiste = 500 μm. Abkürzungen: DIV = erster Tag in der Vordifferenzierung; h-SC-NES = aus dem menschlichen Rückenmark gewonnener neuroepithelialer Stamm; GFP = grün fluoreszierendes Protein; DEV = Tag ex vivo; OM = organotypisches Medium; GM = Transplantatmedium; DPT = Tage nach der Transplantation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig06.jpg"> Abbildung 6: Bewertung der Apoptoserate von transplantierten h-SC-NES-Zellen nach 30 Tagen nach der Transplantation. (A) Repräsentatives Bild eines organotypischen Mausschnitts, der mit GFP-exprimierenden h-SC-NES-Zellen transplantiert wurde. Die Zellen werden mit einem lentiviralen Vektor transduziert, der das GFP-Gen trägt, um sie nach der Transplantation in die Schnitte zu überwachen. Die GFP-Expression im Laufe der Zeit bestätigt ihre Lebensfähigkeit und Anpassung an die Schnittumgebung. Der angezeigte Zeitpunkt ist DPT 30; Die Zellen werden für menschliche Zellkerne (cyan) und aCASP3 (rot) gefärbt. Maßstabsbalken = 150 μm. (B) Links ein repräsentatives Tortendiagramm der Apoptose-Analyse von Zellen, die in Schichten bei DPT 30 transplantiert wurden (N (Replikate) = 5 Schichten, n (Zellen) = 5.000), und rechts ein Ausschnitt von Hu-Nu+ -Zellen und ein Detail einer Zelle, die positiv auf aCASP3 ist (weißer Pfeil). Maßstabsleiste = 75 μm. Kleine rote Punkte markieren Zelltrümmer und pyknotische Zellkerne. Abkürzungen: h-SC-NES = human spinal cord-derived neuroepithelial stem; GFP = grün fluoreszierendes Protein; DPT = Tag nach der Transplantation; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; NFL = Neurofilament-Leichtkette; aCASP3 = aktive Caspase-3; Hu-Nu = menschliche Zellkerne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Tabelle 1: Zusammensetzung der in diesem Protokoll verwendeten Lösungen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704_Tables%20of%20Solutions%20rev.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

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In dieser Arbeit stellen wir eine reproduzierbare Methode zur Generierung und Erhaltung von organotypischen Schnitten des Rückenmarks vor, die mit neuralen Stammzellen transplantiert wurden, als ex vivo-Modell für die Erprobung von zellulären Ersatztherapien.

Resolutive cures for spinal cord injuries (SCIs) are still lacking, due to the complex pathophysiology. One of the most promising regenerative approaches ...

Wir sind daran interessiert, einen vielversprechenden regenerativen Ansatz zur Behandlung von Rückenmarksverletzungen zu entwickeln. In diesem Artikel validieren wir das organotypische Modell des Rückenmarks für die Erprobung von Zellersatztherapien in der Rückenmarksforschung. Bisher werden organotypische Modelle des Rückenmarks zwei bis drei Wochen in vitro in Kultur gehalten.Und Subkulturmedien sind suboptimal für die Transplantation, Differenzierung und Reifung von neuralen Stammzellen. Zellersatztherapien erfordern immer noch die Verbesserung, um die Fähigkeit der transplantierten Zellen zu verkünden, die verlorenen Schaltkreise wiederherzustellen. Mit diesem Protokoll stellen wir eine neuartige, langfristige Ex-vivo-Plattform zur Verfügung, um Probleme im Zusammenhang mit Zelltransplantationen wie Überleben, Integration und Reifungsrate der transplantierten neuralen Stammzellen anzugehen.Diese Plattform wird für Forscher hilfreich sein, um die beste Strategie für die Zelltransplantation zu finden und die Anzahl der für die In-vivo-Validierung erforderlichen Tiere zu reduzieren. Unser Protokoll ist einfach, schnell und kostengünstig, um Proof-of-Concept- und Optimierungsstudien durchzuführen.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Long-Term Mouse Spinal Cord Organotypic Slice Culture as a Platform for Validating Cell Transplantation in Spinal Cord Injury

679 Aufrufe.  University of Pisa. Wir sind daran interessiert, einen vielversprechenden regenerativen Ansatz zur Behandlung von Rückenmarksverletzungen zu entwickeln. In diesem Artikel validieren wir das organotypische Modell des Rückenmarks für die Erprobung von Zellersatztherapien in der Rückenmarksforschung. Bisher werden organotypische Modelle des Rückenmarks zwei bis drei Wochen in vitro in Kultur gehalten.Und Subkulturmedien sind suboptimal für die Transplantation, Differenzierung und Reifung von neuralen S...