Çalışma, Wings for Life Vakfı (WFL-IT- 20/21), Avrupa Birliği Yeni Nesil AB-Ulusal Toparlanma ve Dayanıklılık Planı (NRRP)-misyon 4 bileşen 2, yatırım n. 1.4-CUP N. B83C22003930001 (Toskana Sağlık Ekosistemi-THE, Spoke 8) ve Marina Romoli Onlus tarafından desteklenmiştir. Bu yazı sadece yazarların görüş ve düşüncelerini yansıtmaktadır, ne Avrupa Birliği ne de Avrupa Komisyonu bunlardan sorumlu tutulamaz. Veriler ve meta veriler Zenodo 10.5281/zenodo üzerinde mevcuttur.10433147. Görüntüler Biorender https://www.biorender.com/ ile oluşturulmuştur.

Spinal Kord Organotipik Kültürlerinde H-SC-NES Hücrelerinin Uzun Süreli Engraftmanı

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Farklı yaklaşımlar test edilmiştir ve en umut verici olanlardan biri rejeneratif bir strateji hücre replasmanına dayanmaktadır. Şu anda, rejeneratif tıp alanındaki gelişmeler, hücre nakillerinin etkinliğini ve güvenliğini tek başına veya diğer yaklaşımlarla kombinasyon halinde test etmek için yeni platformlar gerektirmektedir. Klinik öncesi doğrulamaları, daha ileri klinik çalışmalara devam etmek için esastır. SK organotipik kültürler, nörodejenerasyon, nöral rejenerasyon ve nörogelişimin farklı yönlerini incelemek ve yeni terapötik yaklaşımların etkinliğini araştırmak için yararlı bir platformdur23. Özellikle, organotipik kültürlerin orijinal histomimarisinin ve hücre ve mikroçevre bileşiminin korunması gibi spesifik özellikleri, hücre aşılaması, entegrasyon, farklılaşma ve olgunlaşma gibi transplantasyon dinamiklerini çözmek için avantajlıdır.
Yayınlanmış protokollerle tutarlı olarak, SC organotipik dilimler sağlıklı koşullarda yaklaşık 2-3 hafta kültürde tutulabilir, bu da hücre tedavisinin test şemaları için gerekli olan uzun süreli araştırmalar ve fonksiyonel tarama için kullanımlarını sınırlar. SK dokusu içinde nakledilen hücrelerin doğru kaderine doğru farklılaşma ve olgunlaşma gibi önemli süreçleri araştırmak, uzun süreli izleme gerektirir. Bu hücresel süreçler, hayvan modellerinde yaygın nakiller sırasında kritik öneme sahiptir. İn vivo olarak mevcut birçok özelliği taklit eden bir ex vivo sistemin varlığı, klinik öncesi tarama aşamasında yardımcı olacaktır.
Bu nedenle, bu çalışmada, canlı SC dilimlerinin 90 güne kadar korunmasına izin veren ve normal kültür zaman çerçevelerini üç katına çıkaran optimal bir uzun vadeli (≥30 gün) SC organotipik kültür yöntemi öneriyoruz. Ayrıca, SC dilimleri içinde stabil h-SC-NES hücre engraftmanı ve nakil kültürünün 30 güne kadar sürdürüldüğünü gösteriyoruz. DPT 30'a kadar hücre sağkalımını doğrulamak için GFP ekspresyonunu gözlemleyerek zaman içinde hücre aşılamasını izledik. 30 DPT sonrası hücre apoptoz oranını değerlendirdik. Literatürde, nakledilen h-SC-NES hücrelerinin 7 DPT'de SC-kesitlerde apoptozisinin değerlendirilmesi bildirilmiştir40. Burada, apoptotik oranı daha önceki zaman noktasına (DPT 7) göre karşılaştırmak için DPT 30'da hücre apoptoz analizini genişlettik. Verilerimizin literatürle uyumlu olduğunu bulduk, bu da nakledilen h-SC-NES hücrelerinin, çalışmamızda optimize edilmiş kültür koşullarında tutuldukları takdirde daha sonraki bir zaman noktasında da hayatta kaldıklarını gösteriyor. Bu geliştirilmiş uzun vadeli ex vivo platform tek başına ve nakil konfigürasyonunda, araştırmacılara SCI için kök hücre bazlı nakiller için klinik öncesi taramada yardımcı olacaktır. Bu, nakillerin başarısını teşvik eden daha ileri in vivo çalışmalar için en iyi hücre adayını belirlemelerine olanak sağlayacaktır. Ayrıca, ilk taramadan sonra, SC organotipik dilimler, hayvan modellerinde gözlemlenen uzun vadeli hücresel dinamikleri ve davranışları doğrulamak ve desteklemek veya mekanik çalışmaları desteklemek için in vivo çalışmalara paralel olarak da kullanılabilir.
Protokolümüz, bu uzun vadeli organotipik modelin nasıl oluşturulacağını ayrıntılı olarak açıklamaktadır, ancak bazı kritik adımların da tartışılması gerekmektedir. SK organotipik kültürlerin oluşumu ile ilgili olarak, cerrahi ve kültürün ilk aşamaları sırasında bazı zorluklar vardır. Orijinal histomimariyi koruyan dilimler oluşturmak için iyi yapılmış bir cerrahi prosedür şarttır. İzolasyon sırasında SC bozulursa, dilimler tipik anatomik yapılarını kaybedebilir ve doku hasarı, sağlıksız koşullara ve hücre ölümüne yol açan aşırı bir pro-inflamatuar hakarete neden olabilir. Ameliyat sırasında en zorlu aşama omurgadan SK'nin çıkarılması ve izole edilen SK'den meninkslerin çıkarılmasıdır. Bu adımların başarısı operatörün deneyimine bağlıdır; Bu nedenle, deneylere başlamadan önce bir eğitim dönemi önerilir.
SC'nin bir kıyıcı aracılığıyla koronal kesit alınması da zorlu bir aşamadır. İzole edilmiş SC, bıçağa tam olarak dik olarak kesme tablasına yerleştirilmelidir. Operatör ayrıca bıçağı kesme tablasına dik olarak yerleştirmelidir. Bu önlemler, aynı ve farklı deneyler arasında tekrarlanabilir dilimlerin oluşturulmasını sağlamak için gereklidir. Bir diğer önemli konu ise ameliyat için zamanın sınırlı olmasıdır: tüm dilim oluşturma işleminin ~ 30 dakika sürmesi gerekir. Operatör ameliyat ve kesme için daha fazla zaman harcarsa, SC dokusu zarar görür ve bu da kültürün başarısını ve deneyin sonraki adımlarını bozabilir.
Dilimler kültür zarına yerleştirildikten sonra, onları doğru şekilde beslemek önemlidir. GDNF, doku iyileşmesini ve sağkalımını sürdürmek için gereklidir. Bir kıyıcı ile kesmek doku için travmatiktir ve bu nedenle, pro-enflamatuar ve ölümü teşvik eden moleküllerin fazlalığını temizlemek için kesimden kısa bir süre sonra buz gibi soğuk bir diseksiyon ortamına dilimler yerleştirilir. Daha sonra, daha hızlı bir toparlanma ve zara dilim yapışmasını teşvik etmek için GDNF ile modifiye edilmiş taze besiyeri ile kültür zarlarına (hücre kültürü ekleri) dilimler yerleştirilir. GDNF, kısa yarılanma ömrü50,51 nedeniyle kültürdeki ilk hafta boyunca her gün ortama eklenmelidir. Doku iyileşmesini ve canlılığını desteklemek için dilimlerin kültürdeki ilk günlerde sürekli GDNF varlığına ihtiyaç duyduğunu gözlemledik. Her halükarda, GDNF'nin varlığı tüm kültürleme dönemi için önemli olduğundan, GDNF uygulamasının daha sonraki zaman noktalarında kesintiye uğratılması kesinlikle önerilmez.
Kültürdeki ilk hafta boyunca, dilimleri makroskopik olarak gözle ve mikroskopta kontrol etmek de önemlidir. Yarı saydam doku ve sınırların şeffaflığı, dilimlerin zara ve canlı dokuya düzgün bir şekilde yapıştığının işaretleridir. Nekrotik doku ilk makroskopik bakışta son derece beyaz görünecek ve nekrotik alanlar mikroskopta koyu gri görünecektir. Kültürde birkaç hafta sonra, dokunun morfolojisi değişebilir: hücre hareketleri ve zara doku yapışması bu süreci etkileyebilir. Örneğin, hücrelerle dolu bazı dilimlerde merkezi lümen kaybını ve dorsal ve ventral boynuz morfolojisinin kaybını gözlemledik. Bu, esas olarak daha küçük dilimlerde olurken, çoğu orijinaline yakın bir anatomik yapıyı koruyacaktır. Dilimler genellikle lomber veya torasik bölgelerden üretilir, çünkü bu şekilde zaman içinde orijinal histomimarilerini korumak için uygun boyuta sahip olabilirler: çok küçüklerse mimarilerini kaybederler, çok büyüklerse merkezi bölge nekroza girebilir. Bu nedenle, optimum uzun vadeli kültürleme için uygun boyutta dilimler oluşturmak için fare yavrularının bel bölgesini kullandık, ancak prensip olarak diğer segmentler de düşünülebilir. Ayrıca ventral ve dorsal bölgeler birbirinden daha belirgin olduğu için lomber bölgeyi kullanmayı tercih ettik. Ek olarak, bu bölge, SCI'de hücre replasman tedavileri için ilgi alanları olan daha yüksek oranda motor nöronlar ve gri cevher içeren doku alanları sunar. Hücrelerin dilimlere nakli ile ilgili asıl sorun, cam mikroiğne ucunun kırılması ile ilgilidir. Hücrelerin geçişi için delik çok büyükse, mikroenjeksiyon sırasında SC dokusuna zarar verebilir. Çok küçükse, hücre istiflenmesi iğneyi tıkayarak nakil sürecini engelleyebilir. Hücre acısını ve ölümünü en aza indirmek için transplantasyon prosedürü 1 saat içinde tamamlanmalıdır.
Önerilen protokol, farklı araştırma türleri için optimal ve çok yönlü bir araç sağlar. Burada, 30 gün boyunca fare SC dokusu içindeki farklılaşmanın ilk aşamalarında h-SC-NES hücrelerinin transplantasyonunu doğrulamak için uzun vadeli platformumuzu uyguluyoruz. Önerilen yaklaşımın ana yeniliği, ko-kültür protokolünün optimizasyonudur. GM'nin bileşenleri, SC dilimlerinin ve nakledilen h-SC-NES hücrelerinin uzun süreli nöronal sağkalımını sürdürür. Gerçekten de, serum içermeyen bir ortam olan GM, daha önce organotipik dilim kültürü47 için kullanılan ortama göre nakledilen hücrelerin nöronal kadere doğru farklılaşmasını sürdürür.
SCI için önerilen modellerle ilgili olarak, deneyler genellikle yetişkin fareler üzerinde gerçekleştirilir. Şimdiye kadar, yenidoğan ve yetişkin SK arasındaki en önemli farklar, yetişkin farelere göre yenidoğanda bulunan daha yüksek rejeneratif potansiyel ile ilgilidir52. Bununla birlikte, bu tür farklılıkların önerdiğimiz protokol türü üzerinde hiçbir etkisi yoktur, çünkü burada aşılanmış hücrelerin yerleşik nöronların rejenerasyon yeteneklerinden ziyade ev sahibi doku ortamına verdiği tepkiye odaklanıyoruz. SCI'den sonra yenidoğan ve yetişkin fareler arasındaki diğer bir fark, yetişkinlerde ortaya çıkan glial skar oluşumu ile ilgilidir. Bu husus, birincil ve ikincil yaralanmalardan kaynaklanan karmaşık fizyopatolojik süreçleri dikkate almayan önerilen modelde dikkate alınmamaktadır.
Uygulamalarla ilgili olarak, platform, nakledilen hücreler ile SC organotipik modelinde bulunan yerleşik devreler arasındaki entegrasyonu araştırmak için de kullanılabilir. Genetik mühendisliği araçları, sinaptik bağlantıyı değerlendirmek için CNS'de zaten kullanılıyordu ve bu bağlamda kullanılabilirdi 53,54,55. Özellikle, engrafta hücreler ve SC ex vivo doku arasındaki sinaps oluşumu değerlendirilerek entegrasyon araştırılabilir ve doğrulanabilir. Bu uzun süreli organotipik kültürler, nöroprotektif ve nörorejeneratif ajanları veya yeni molekülleri/materyalleri test etmek veya SK'yi içeren nörodejeneratif bozuklukları incelemek için de kullanılabilir. Spesifik nörodejeneratif bozuklukları incelemek için, protokolün, patoloji için ilgili aşamada (yani yenidoğan, genç, yetişkin) spesifik patoloji ile ilişkili mutasyonları taşıyan transgenik fareler gibi ilgili modellerden üretilen SC dilimlerinin kültürlenmesi için uyarlanması gerekir. Sonuç olarak, protokolümüz ve genel olarak organotipik kültürlerimiz, belirli bir organın eksplantları olarak, 2D hücre kültürleri ile in vivo modeller arasındaki boşluğu dolduran özellikler sunar ve bunları hem temel araştırmalar hem de klinik öncesi testler için paha biçilmez bir araç olarak onaylar.

Travmatik omurilik yaralanmasının (SKY) hastalar ve bakıcılar için yıkıcı fiziksel, psikolojik ve ekonomik sonuçları vardır1. Farklı yaklaşımlarla SCI'de aksonal rejenerasyonu teşvik etmek için birçok girişimde bulunulmuştur 2,3,4 ve hücre replasman tedavileri yoluyla yaralanma bölgesindeki proksimal ve distal nöronlar arasında nöronal rölelerin oluşumu ile bazı yararlı etkiler gösterilmiştir. Hücre tedavilerine olan ilgi hala artmaktadır5 çünkü nakledilen hücreler trofik destek sağlama, bağışıklık modülasyonu, plastisite indüksiyonu yoluyla kayıp nöral devrelerin yenilenmesi, hücre replasmanı ve akson remiyelinizasyonu6 dahil olmak üzere birçok rol oynayabilir.
Son zamanlarda, bu alandaki ana çaba insan nöral kök/progenitör hücrelerine (NSC'ler/NPC'ler) odaklanmıştır7. Birkaç çalışma, NSC'lerin/NPC'lerin astrosit yanıtı8'i modüle ettiğini, prorejeneratif faktörlerin9,10 salgılanmasını teşvik ettiğini ve SCI 11,12'deki eksik nöronal hücrelerin yerini aldığını göstermektedir. Bununla birlikte, nakledilen hücrelerin fonksiyonel nöronlara farklılaşmasını destekleyen çalışmalar hala zayıftır. Ayrıca, yaralı omurilikte (SC) nakledilen hücre sağkalımı ve farklılaşması düşüktür13, çünkü muhtemelen nakledilen hücrelerin in vivo olarak farklılaşması birkaç hafta, hatta aylar alır. Ek olarak, mevcut çalışmalar hücre replasman tedavilerinin birçok biyokimyasal, moleküler, hücresel ve fonksiyonel yönünü tam olarak aydınlatmamıştır. Bu bağlamda, hücre aşılama mekanizmalarını, aşılanmış hücrelerin çoğalma, belirli hücre tiplerine veya alt popülasyonlarına farklılaşma ve yerleşik nöronlarla sinapslar oluşturma yeteneklerini incelemek için basit, hızlı ve uygun maliyetli modeller gereklidir.
Histolojik çalışmaların elektrofizyolojik kayıtlara ve transkriptom ve proteom profillemesine entegre edilmesi, hücre transplantasyonundan sonra meydana gelen moleküler kaskadının tam olarak anlaşılması için gereklidir. Bu kesinlikle klinik öncesi modellerde ve klinik çalışmalarda yeni hücre replasman tedavilerinin tasarımını ve doğrulanmasını hızlandıracaktır. Gerçekten de, bugüne kadar, kemirgenlerin, büyük hayvanların ve insan olmayan primatların kullanımı, transplantasyondan sonraki birçok hücresel süreci aydınlatmak için değerli olmuştur14. Bununla birlikte, yüksek maliyet, yüksek etik etki ve organizmanın karmaşıklığı nedeniyle, kullanımları genellikle basit değildir veya biyokimyasal ve moleküler süreçleri çözmek için yeterli değildir. Ek olarak, hem türler arası (metabolizma) hem de tür içi değişkenlik (cinsiyet, yaş) gibi biyolojik farklılıklarla ilişkili birçok dezavantaj sunabilirler.  Bu faktörler, stresli durumlar gibi dış faktörlerle birlikte, bir deneyin sonucunu ve insanlara terapötik çeviri açısından öngörülebilirliğini değiştirebilir 15,16,17.
Bu nedenle, birçok grup, hayvan modellerine ek olarak 2D in vitro hücre kültürü ve ex vivo organotipik dilimler (ex vivo kültürler) kullanır. 2D hücre kültürü, tek hücre ve/veya hücre popülasyonu düzeyinde belirli biyolojik süreçleri incelemek için en yaygın kullanılan sistemdir. Bununla birlikte, tek katmanlı hücre kültürleri, bütün bir organizmada bulunan karmaşıklığı yansıtmaz. Doku yapılarının ve fizyolojik ortamın olmaması, 2D kültür sistemlerinin araştırılan dokunun temel yapısal, morfolojik ve fonksiyonel yönlerini tamamen taklit etmesine izin vermez 18,19,20.Organotipik kültürler bu sorunların bazılarının üstesinden gelebilir. Organotipik modeller, bir doku veya organın bir parçasının çıkarılmasına ve sınırlı bir süre için ex vivo olarak korunmasına dayanır21,22. Özellikle, ekilen dokunun dilimleri, besin maddelerinin dilimlerdeki hemen hemen tüm hücrelere kolayca ulaşmasını sağlayan kesin bir kalınlıkta üretilir. Hipokampus, hipotalamus, beyincik, talamus, serebral korteks, substantia nigra ve striatum ve omurilik gibi merkezi sinir sisteminin çeşitli bölgelerinden üretilebilirler23. Organotipik kültürler, doku mimarisini, hücrelerin mekansal dağılımını, hücresel çeşitliliği ve orijin organın çevresini (yani hücre dışı matris bileşimini) korur. Ayrıca, orijinal nöral aktiviteyi, hücreler arasındaki bağlantıları ve özellikle eksplanttan sonra kısa mesafeli devreleri korurlar.
Bu yönler, hem tek katmanlı kültürler hem de hayvan modelleri açısından ex vivo kültürler için bazı avantajlar sağlar. İn vivo bulunan temel doku özelliklerini korurlar, ancak maliyetlerin azaltılması ve kültür çevresel parametrelerinin doğru bir şekilde düzenlenmesi ile farklı türde moleküler, hücresel ve fonksiyonel deneyler gerçekleştirme imkanı ile 24,25,26,27,28,29. Organotipik dilimler, belirli durumların temel histopatolojik özelliklerine benzeyerek farklı nörolojik bozukluklar için modeller geliştirmek için de kullanılabilir30. Ayrıca, orijinal çok hücreli doku ortamının korunması, onları ilaç taraması ve nöroprotektif ve nöro-rejeneratif molekülleri ve materyalleri test etmek için uygun platformlar haline getirir.
Bu çalışmada, NSC nakillerini optimize etmek için SC organotipik kültürlerin bir model olarak kullanılmasını öneriyoruz. Bu önemsiz değildir, çünkü hem konakçının (SC dokusu) hem de naklin (NSC'ler) haftalarca hayatta kalmasını garanti etmek için optimal kültür koşulları gereklidir. Organotipik kültürlerde, beyin kaynaklı ve SC türevli, çeşitli hücre tiplerinde aşılanmış farklı araştırma grupları. Çalışmaların çoğu mezenkimal kök hücrelerin (31,32,33), koku alma kılıf hücrelerinin34 veya NSC'lerin35,36,37,38,39,40 transplantasyonunu gösterdi ve aşılanmış hücrelerin konak hücrelerle etkileşimlerini, tüm sistemin hayatta kalmasını ve nakledilen hücrelerin nöronlara mı yoksa nöron benzeri hücrelere mi farklılaştığını değerlendirdi ex vivo doku ortamı içinde 32,33,41. Bazıları, nakil sonrası hücrelerin rejeneratif potansiyelini değerlendirdi, doku içindeki aksonal büyümelerinigözlemledi 37,40,41, oligodendrositlerin42 aşılanmış öncülerinin miyelinasyon yeteneğini, aşılanmış hücrelerin konakçı dokuya göçünü43 ve nakledilen hücrelerin prorejeneratif bir ortama doğru iten faktörleri serbest bırakıp bırakmadığını31. Mevcut çalışmaların bir sınırlaması, uzun süreli bir süre boyunca aşılamayı araştırmamalarıdır.
NSC'lerin in vivo 44,45 ayırt etmek için birkaç haftaya ihtiyaç duyduğu göz önüne alındığında, bu çalışma uzun süreli (≥30 gün) fare SC dilimlerinin nasıl oluşturulacağına ve 90 güne kadar nasıl sürdürüleceğine odaklanmaktadır. Dilimlerin orijinal anatomik yapılarını korudukları ve zaman içinde düşük ve stabil bir apoptotik oranı ve yüksek hücre canlılığını korudukları bulundu. Nöronal belirteçler RNA bağlayıcı fox-1 homolog 3 (RBFOX3) ve nörofilament hafif zincirin (NFL) yaygın ekspresyonunu gözlemledik, ikincisi zamanla dilimlerin etrafında artan bir aksonal filizlenme eğilimi gösterdi ve sağlıklı durumlarını doğruladı. Ayrıca, nöronal farklılaşmanın ilk aşamalarında SC dilimleri GFP eksprese eden insan SC türevli nöroepitelyal kök (h-SC-NES) hücrelerine başarılı bir şekilde nakledildi. NSC grefti, nakilden sonra 30 gün boyunca korundu ve hücreler kültürdeki tüm süre boyunca GFP ekspresyonu gösterdi. Nakil sonrası gün (DPT) 30'daki hücrelerin apoptotik oranının, aynı hücrelerde40 DPT 7'de gözlenen apoptotik hız değerine göre de uyumlu olduğu bulundu. Hücreler doku ortamına aşılanmış gibi görünüyordu ve birkaç haftaya kadar hayatta kaldı.
Özetle, verilerimiz SK organotipik dilimlerin orijinal sitomimarisinden ve doku ortamından ödün vermeden 3 ay boyunca kültürde tutulmasının mümkün olduğunu göstermektedir. En önemlisi, in vivo bir deneye devam etmeden önce hücre tedavilerini test etmek için kullanılabilirler, böylece maliyetleri ve deney süresini azaltırlar. Burada, fare SC organotipik dilimleri oluşturmak için tüm pasajları ve bunların uzun süreli süreler boyunca (≥30 gün) nasıl korunacağını ayrıntılı olarak gösteriyoruz. Ayrıca, dilimlere NPC naklinin nasıl gerçekleştirileceğini ve bunların aşağı akış analizi için nasıl korunacağını derinlemesine açıklıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-cleaved Caspase-3,&#160; (Asp175) (5A1E) (Rabbit)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9661S</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP (Mouse) - monoclonal</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>G6539</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Human Nuclei (Mouse) - monoclonal, clone 235-1&#160;</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>MAB1281</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Human Nuclei (Rabbit)</td>
			<td>NeoBiotechnologies</td>
			<td>RBM5-346-P1</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NeuN (RBFOX3) (Rabbit) - polyclonal</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>ABN78</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NFL (Mouse)</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>MAB1615</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NFL H-Phospho (Rabbit) -polyclonal</td>
			<td>Biologend</td>
			<td>840801</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Polymount</td>
			<td>Poly-sciences</td>
			<td>18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC7074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>118364227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture graded water</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>W3500-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from rat tail</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>C7661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope - A1 Confocal Microscope (Eclipse Ti)</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>gf144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-2</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>03-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>SRP3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries, 3.5&#34;&#160;</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti Mouse IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti Mouse IgG Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21236</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti Rabbit IgG Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11011</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti Rabbit IgG Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21244</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph Pad-Prism</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td></td>
			<td>Software for Statistical Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-050</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral prep</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>17446-LV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L32250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11090-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>to load cells in the needle for transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell cell culture membrane</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscroscope cover glasses</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>ECN 631-1572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (35mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pasteur pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1171.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV830</td>
			<td>Microinjector for transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>SWAN3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle #3</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope for imaging and acquisition</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope for surgery</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers-Dumont #5-inox</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Scissors, 8.5 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical micropipette puller</td>
			<td>Shutter Instrument</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254/50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term mouse spinal cord organotypic slice culture as a platform for validating cell transplantation in spinal cord injury

Karmaşık patofizyoloji nedeniyle omurilik yaralanmaları (SCI'ler) için kalıcı tedaviler hala eksiktir. En umut verici rejeneratif yaklaşımlardan biri, kaybedilen dokuyu yerine koymak ve fonksiyonel iyileşmeyi desteklemek için kök hücre transplantasyonuna dayanmaktadır. Bu yaklaşım, daha pahalı ve zaman alıcı hayvan testlerine devam etmeden önce güvenlik ve etkinlik için in vitro ve ex vivo olarak daha iyi araştırılmalıdır. Bu çalışmada, SCI'ler için hücresel replasman tedavilerini test etmek için insan nöral kök hücreleri ile nakledilen fare omuriliği (SC) organotipik dilimlerine dayanan uzun vadeli bir platformun kurulmasını gösteriyoruz.
Standart SC organotipik kültürler in vitro olarak yaklaşık 2 veya 3 hafta korunur. Burada, 90 güne kadar uzun süreli bakım (≥30 gün) için optimize edilmiş bir protokol açıklıyoruz. SC dilimlerinin uzun süreli kültürlenmesi için kullanılan besiyeri, nöral kök hücrelerin organotipik modele nakli için de optimize edilmiştir. Yeşil floresan protein (GFP) raportörü taşıyan insan SC kaynaklı nöroepitelyal kök (h-SC-NES) hücreleri, fare SC dilimlerine nakledildi. Nakilden otuz gün sonra, hücreler hala GFP ekspresyonu ve düşük bir apoptotik oran gösteriyor, bu da optimize edilmiş ortamın hayatta kalmalarını ve doku içindeki entegrasyonlarını sürdürdüğünü gösteriyor. Bu protokol, SC dokusunda hücre replasman tedavilerini verimli bir şekilde test etmek için sağlam bir referansı temsil eder. Bu platform, araştırmacıların farklı hücre nakli tedavilerinin ex vivo ön taramasını yapmalarına olanak tanıyacak ve in vivo deneylere devam etmeden önce en uygun stratejiyi seçmelerine yardımcı olacaktır.

Traumatic spinal cord injury (SCI) has devastating physical, psychological, and economic consequences for patients and caregivers1. Many attempts have been made to promote axonal regeneration in SCI with different approaches2,3,4 and some beneficial effects were demonstrated by the formation of neuronal relays between proximal and distal neurons in the injury site through cell replacement therapies. The interest in cell therapies is still growing5 since transplanted cells can play many roles, including providing trophic support, immune modulation, regenerating lost neural circuits through induction of plasticity, cell replacement, and axon remyelination6.
Recently, the main effort in the field focused on human neural stem/progenitor cells (NSCs/NPCs)7. Several studies suggest that NSCs/NPCs modulate astrocyte response8, promote the secretion of proregenerative factors9,10, and replace missing neuronal cells in SCI11,12. However, studies that support the differentiation of transplanted cells into functional neurons are still poor. Moreover, transplanted cell survival and differentiation in the injured spinal cord (SC) are low13, possibly because transplanted cells take several weeks, even months, to differentiate in vivo. Additionally, current studies have not completely elucidated many biochemical, molecular, cellular, and functional aspects of cell replacement therapies. In this context, simple, fast, and cost-effective models are required to study the mechanisms of cell engraftment, the ability of engrafted cells to proliferate, differentiate into specific types or subpopulations of cells, and form synapses with resident neurons.
Integrating histological studies into electrophysiological recording and transcriptome and proteome profiling is necessary for a full comprehension of the molecular cascade occurring after cell transplantation. This certainly will speed up the design and validation of new cell replacement therapies in preclinical models and clinical studies. Indeed, to date, the use of rodents, large animals, and non-human primates has been worthwhile for elucidating many cellular processes after transplantation14. However, due to the high cost, the high ethical impact, as well as the complexity of the organism, their use is often not straightforward or not adequate to unravel biochemical and molecular processes. In addition, they may present many disadvantages correlated with biological differences, both interspecies (metabolism) and intraspecies variability (sex, age).&#160;&#160;These factors, together with external factors such as stressful situations, could alter the outcome of an experiment and their predictability in terms of therapeutic translation to humans15,16,17.
Thus, many groups employ 2D in vitro cell culture and ex vivo organotypic slices (ex vivo cultures) in addition to animal models. 2D cell culture is the most commonly used system for studying specific biological processes at a single-cell and/or cell population level. Nevertheless, monolayer cell cultures do not reflect the complexity found in a whole organism. The lack of tissue structures and&#160;physiological environment does not allow the 2D culture systems to completely emulate key structural, morphological, and functional aspects of the investigated tissue18,19,20. Organotypic cultures can overcome some of these issues. Organotypic models are based on explanting a fragment of a tissue or organ and maintaining it ex vivo for a limited period21,22. In particular, slices of the explanted tissue are generated with a precise thickness that allows nutrients to easily reach almost all the cells in the slices. They&#160;can be generated from various regions of the central nervous system, such as the hippocampus, hypothalamus, cerebellum, thalamus, cerebral cortex, substantia nigra and striatum, and spinal cord23. Organotypic cultures retain the tissue architecture, the spatial distribution of cells, the cellular diversity, and the environment (i.e., extracellular matrix composition) of the organ of origin. Moreover, they preserve the original neural activity, connections between cells, and in particular, short-distance circuits after the explant.
These aspects provide some advantages for ex vivo cultures with respect to both monolayer cultures and animal models. They retain key tissue features found in vivo but with the reduction of the costs and the possibility to perform different types of molecular, cellular, and functional experiments with an accurate regulation of the culture environmental parameters24,25,26,27,28,29. Organotypic slices can also be exploited to develop models for different neurological disorders by resembling key histopathological features of specific conditions30. Moreover, the retention of the original multicellular tissue environment renders them appropriate platforms for drug screening and for testing neuroprotective and neuro-regenerative molecules and materials.
In this work, we propose the use of SC organotypic cultures as a model to optimize NSC transplants. This is not trivial since optimal culturing conditions are required to guarantee the survival of both the host (SC tissue) and the transplant (NSCs) for weeks. Different research groups engrafted in organotypic cultures, brain-derived and SC-derived, various types of cells. Most of the works showed the transplantation of mesenchymal stem cells31,32,33, olfactory ensheathing cells34, or NSCs35,36,37,38,39,40 and evaluated the interactions of engrafted cells with the host cells, the survival of the whole system, and whether the transplanted cells differentiated into neurons or neuron-like cells inside the ex vivo tissue environment32,33,41. Some of them evaluated the regenerative potential of cells after transplant, observing their axonal growth inside the tissue37,40,41, the myelinating ability of engrafted precursors of oligodendrocytes42, the migration of engrafted cells into the host tissue43, and whether the transplanted cells released factors pushing towards a proregenerative environment31. One limitation of the current studies is that they do not explore the engraftment for a long-term period.
Considering that NSCs seem to require several weeks to differentiate in vivo44,45, this study focuses on how to generate and maintain long-term (&#8805;30 days) mouse SC slices for up to 90 days. Slices were found to retain their original anatomical structure and to maintain a low and stable apoptotic rate over time and high cell viability. We observed diffuse expression of neuronal markers RNA binding fox-1 homolog 3 (RBFOX3) and neurofilament light chain (NFL), with the latter showing an increasing trend of axonal sprouting around the slices over time, attesting to their healthy condition. Moreover, we successfully transplanted into the SC-slices GFP-expressing human SC-derived neuroepithelial stem (h-SC-NES) cells at the first stages of neuronal differentiation. The NSC graft was maintained for 30 days after transplant and cells showed GFP expression for all the period in culture. The apoptotic rate of cells at day post-transplant (DPT) 30 was also found to be in line with respect to the apoptotic rate value observed at DPT 7 in the same cells40. Cells seemed to engraft into the tissue environment and survived up to several weeks.
In summary, our data demonstrate that it is possible to maintain in culture SC organotypic slices for 3 months without compromising their original cytoarchitecture and the tissue environment. Most importantly, they can be exploited to test cell therapies before proceeding with an in vivo experiment, thus reducing the costs and the experimental time. Here, we illustrate in detail all the passages to generate mouse SC organotypic slices and how to maintain them for long-term periods (&#8805;30 days). Moreover, we deeply explain how to perform NPC transplantation into the slices and how to maintain them for downstream analysis.

Yazar Spotlight: Omurilik Rejenerasyon Tedavilerini İlerletmek için Uzun Süreli Omurilik Dilimi Kültürü

Omurilik Yaralanmasında Hücre Transplantasyonunu Doğrulamak için Bir Platform Olarak Uzun Süreli Fare Omurilik Organotipik Dilim Kültürü

We are interested in developing a promising regenerative approach to address spinal cord injuries. In this paper, we validate spinal cord organotypic model for testing cellular replacement therapies in spinal cord research. So far, spinal cord organotypic models are maintained in culture for two or three weeks in vitro.And subculture media are suboptimal for neural stem cell engraftment, differentiation, and maturation. Cell replacement therapies still require the improvement to announce the ability of the grafted cells to reconstitute the lost circuits. Through this protocol, we provide a novel, long-term ex vivo platform to tackle cell transplant related issue like survival, integration, and maturation rate of the engrafted neural stem cells.This platform will be helpful for researchers to find the best strategy for cell transplantation, reducing the number of animals required for in vivo validation. Our protocol is simple, fast, and cost-effective to perform proof of concept and optimization studies.

Tarif edilen yöntemler, P3 evresindeki farelerden SC organotipik dilimlerinin oluşturulmasına ve bunların sağlıklı koşullarda uzun süre kültürde tutulmasına izin verir. Ayrıca, hücrelerin dilimlere nakledilmesi ve 30 güne kadar birlikte kültürlenmesi için bir protokol gösteriyoruz (Şekil 1). İlk olarak, kültür koşullarının optimizasyonunu ve SC dilimlerinin nakledilen hücrelerle uzun süreli kültürlenmesi için uygun bir protokolü gösteriyoruz (Şekil 2A). Dilimler, başlangıçta SC dilimlerinin47 bakımı için en uygun ortam olarak önerilen OM'de DEV 0'dan DEV 2'ye kadar üretilir ve korunur. Bununla birlikte, serum proteinlerinin varlığına bağlı olarak, bu ortam, nakledilen nöral öncü hücrelerin nöronal farklılaşmasını ve olgunlaşmasını sürdürmek için yetersiz olabilir. Gerçekten de, DEV 3'te, nöral sağkalımı destekleyen Nörobazal artı B27 içeren bir formülasyon olan OM'den GM'ye geçişi test ettik ve serum olmadan, doğru nöronal farklılaşmayı inhibe eden ve bunun yerine glial bir kaderi teşvik eden48,49.
Şekil 2B, anahtarı almayan SC dilimlerine kıyasla, DEV 3'teki ortamın OM'den GM'ye değiştirilmesiyle elde edilen sonuçları göstermektedir (kontrol dilimleri OM'de kültürlenmiştir). NFL sinyalinin dilimler içindeki dağılımını nöronal bütünlük için bir belirteç olarak kullandık (Şekil 2B,C). DEV 7'deki dilimler, her iki kültür koşulunda da sağlıklıydı ve içlerindeki nörofilamentin (NFL, yeşil renkte) dağınık dağılımını gösterdi. DEV 10'da, GM'de kültürlenen dilimler, NFL boyama dağılımı tarafından belgelendiği gibi, OM'de kültürlenen kontrol dilimlerine göre daha sağlıklı görünüyordu. Ayrıca, Şekil 2B'nin temsili görüntülerinde gösterilen dilimlerin NFL+ alanını (% NFL+ Alanı/DAPI+ Alanı) tahmin ettik. Tahmini NFL + alanı, Şekil 2C'deki histogramlarda temsil edilir ve NFL sinyalinin her iki koşul altında DEV 7'deki dilimlerde dağınık bir şekilde dağıldığını doğrular. Bununla birlikte, DEV 10'da, OM kültür koşulu için NFL boyamanın kapsadığı tahmini alan azalır.
Bu veriler, DEV 3'te GM'ye geçişin, SC dilimlerinin uzun süreli kültürü için iyi tolere edildiğini göstermektedir (DEV 10). Bir sonraki adım olarak, GM'yi daha uzun zaman noktalarında test ettik: DEV 30, DEV 60 ve DEV 90. Şekil 3A,B'de gösterildiği gibi, dilimler DEV 90'a kadar kültürde sağlıklı tutulmuştur. NFL boyama, her zaman noktasında dilimlerde yaygın olarak bulundu ve merkezi bölgeden ayrılan nörit dilimlerinin etrafında yaygın filizlenme oldu. Gerçekten de, Şekil 3A'da gösterilen dilimlerin NFL+ alanını tahmin ettik ve Şekil 3B'nin histogramlarında gösterildiği gibi zamanla arttı. Ayrıca, nöronal belirteç RBFOX3'te pozitiflik gözlemledik ve bu da dilimlerin nöronal farklılaşmasına dair başka bir kanıt çizgisi sağladı. Her zaman noktasında, aCASP3'e pozitif hücre sayısını farklı dilimlerde değerlendirerek apoptoz oranını da kontrol ettik (Şekil 4A, B). Analiz, protokol bölümü 10.2'de açıklandığı gibi gerçekleştirildi. Apoptotik oran (% aCASP3+ hücre / toplam DAPI+ hücre sayısı) her zaman noktasında çok düşük bulundu (DEV 30, 60 ± 90 için sırasıyla 0.85 %0.52, 0.71 ± %0.27, 0.66 ± %0.45) dikkate alınan üç zaman noktası arasında anlamlı bir fark yoktu (p değeri > 0.05, Şekil 4B). Bu veriler, aCASP3 ile ilişkili apoptotik oranın zaman boyunca sabit kaldığını ve dilimlerdeki NFL'nin geniş dağılımı ile birlikte (Şekil 4A), dilimlerin her zaman noktasında hayatta kaldığını doğruladığını göstermektedir.
Önceki verileri desteklemek için, dilimlerin üç farklı zaman noktasında canlılığını değerlendirmek için canlı / ölü bir test de gerçekleştirdik. Canlı ve metabolik olarak aktif hücreleri etiketlemek için Calcein (yeşil boyama) ve hücre ölümünü değerlendirmek için Sytox (camgöbeği boyama) kullandık. Şekil 4C'deki histogramlarda gösterildiği gibi, metabolik olarak aktif hücrelerin yüzdesi DEV 30'dan DEV 90'a hafifçe artar (DEV 30, 60 ± 90 için sırasıyla% 93.21, 96.43 ±% 3.02, 96.33 ±% 3.10), son iki zaman noktası arasında stabilize olur (DEV 30 ve DEV 60 p-değeri = 0.018; DEV 30 ve DEV 90 p değeri = 0.027; DEV 60 ve DEV 90 p değeri = 0.99). Zamanla azalan düşük hücre ölümü seviyeleri bulduk (DEV 30, 60 ± 90 için sırasıyla% 6.83 %5.21, 3.57 ±% 3.02, 3.66 ± %3.10) ve DEV 30 ve sonraki zaman noktaları, DEV 60 ve DEV 90 arasında anlamlı bir fark bulundu (DEV 30 ve DEV 60 p-değeri = 0.018; DEV 30 ve DEV 90 p değeri = 0.027; DEV 60 ve DEV 90 p değeri = 0.99). Bu veriler, apoptoz oranı ile ilişkili olarak, zaman içinde dilim sağkalımını doğrular ve gerçekleştirilen uzun vadeli kültür protokolünün etkinliğini destekler.
SC dilimlerinin uzun süreli kültürlenmesinin fizibilitesi belirlendikten sonra, nöronal farklılaşmanın ilk aşamalarında h-SC-NES hücrelerinin transplantasyonu ile sisteme meydan okuduk. H-SC-NES hücrelerini test ettik çünkü SCI tedavisi12 için umut verici sonuçlar gösterdiler. H-SC-NES hücrelerinin fare SC dilimlerine transplantasyon prosedürü protokol bölüm 6'da açıklanmıştır. SC dilimleri ve nakledilen h-SC-NES hücreleri DPT 30'a kadar muhafaza edildi. Hücreler, Şekil 5A'daki protokol şemasında gösterildiği gibi, farklılaşmanın DIV 10'unda (nöral öncü aşama) DEV 4 organotipik dilimlere aşılandı. Nakledilen hücreler, kültürde GFP ekspresyonu açısından 30 güne kadar izlendi. Şekil 5B , nakledilen GFP + hücreleri ile bir SC diliminin farklı DPT'de temsili canlı görüntülerini göstermektedir. GFP'nin zaman içindeki kararlı ekspresyonu (Şekil 5B ve Şekil 6A), hücrelerin daha önce optimize edilmiş kültür koşullarında SC dokusuna hayatta kaldığını göstermektedir. Ayrıca, protokol bölümü 10.2'de açıklandığı gibi nakledilen hücrelerin apoptotik oranını da kontrol ettik. 30 DPT'den sonra apoptotik oran (% aCASP3+ hücre / toplam Hu-Nu + hücre sayısı) çok düşük (% 0.44 ± %0.34) bulundu (Şekil 6B). Ayrıca, DPT 30'daki apoptotik oranın, daha önce bildirildiği gibi DPT 7'deki aynı tip hücreler için bulunanla uyumlu olduğu bulundu40, bu da kültürlerin zamanla stabilize olduğunu belgeledi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig01.jpg"> Şekil 1: Protokolün iş akışı. Gerçekleştirilen protokolün genel iş akışını gösteren temsili şema. (A) Solda, P3'teki fare yavrularının izole edilmiş SC'sinden fare SC-dilimi üretimini ve SC organotipik dilimlerinin uzun süreli kültürlenmesini özetleyen bir şema. (B) Sağda, GFP'yi eksprese eden h-SC-NES hücrelerinin fare SC-organotipik dilimlerine transplantasyonunu özetleyen bir şema. Aşılanan hücreler nakilden sonraki 30 gün boyunca korunur. Kısaltmalar: h-SC-NES = insan omuriliğinden türetilmiş nöroepitel sapı; GFP = yeşil floresan proteini; DEV = gün ex vivo; DPT = nakil sonrası gün; NFL = nörofilament hafif zincir; RBFOX3= RNA bağlayıcı tilki-1 homologu 3; aCASP3 = aktif Kaspaz-3; SC= omurilik. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig02v2.jpg"> Şekil 2: Uzun vadeli kültür koşullarının optimizasyonu. (A) OM ve GM'yi test etmek için protokolün temsili şeması. OM, kontrol grubu için DEV 7-10'a kadar sürdürülür. Ortam, işlenmiş dilimler için DEV 3'te GM'ye geçirilir; daha sonra, kontrollerle karşılaştırma için DEV 7-10'da sabitlenirler. (B) Farklı koşullarda kültürlenmiş DEV 7 ve 10'da fare SC organotipik dilimlerini karşılaştıran temsili görüntüler. Hücre iskeleti işaretleyici nörofilament (NFL, yeşil) için dilimler boyanır. GM ile kültürlenmiş dilimlerde NFL boyamanın geniş dağılımı, genel bir sağkalım ve farklılaşma olduğunu düşündürmektedir. Çekirdekler DAPI ile karşı boyanır. Ölçek çubuğu = 500 μm. (C) Şekil 1B'de gösterilen dilimlerde NFL'nin kapsadığı alanın tahmininin temsili histogramları. DEV 10'da, OM kültür koşulunda NFL yüzey alanı azalır. Kısaltmalar: DEV = gün ex vivo; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; NFL = nörofilament hafif zincir.; OM = organotipik ortam; GM = greft ortamı; SC = omurilik. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig03v3.jpg"> Şekil 3: Uzun süreli kültürlenmiş fare SC organotipik dilimleri. (A) Dilimler DEV 90'a kadar kültürde tutulur. İmmünofloresan testi, hücre iskeleti belirteci nörofilamentin (NFL, yeşil) ve nükleer nöronal belirteç RBFOX3'ün (kırmızı) geniş bir dağılımını ortaya çıkarır ve uzun süreli kültürlemeden sonra sağlıklı durumlarını ve nöronal kimliklerini kanıtlar. Dikkat çekici bir şekilde, NFL+ aksonları zamanla dilimlerin etrafında dağınık bir şekilde filizlenir. Çekirdekler DAPI ile karşı boyanır. Ölçek çubuğu = 500 μm. (B) Panel A'da gösterilen dilimlerin NFL+ alanı ve zamanı ve RBFOX3+ alanı tahmininin temsili histogramları. NFL + nörit alanı zamanla artar. Kısaltmalar: DEV = gün ex vivo; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; NFL = nörofilament hafif zincir; SC = omurilik; RBFOX3= RNA bağlayıcı tilki-1 homologu 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig04.jpg"> Şekil 4: SC dilimlerinde zaman içinde hücre canlılığının değerlendirilmesi. (A) aCASP3 (kırmızı) ve NFL (yeşil) için boyanmış DEV 60'taki organotipik dilimlerin temsili görüntüleri. Ölçek Çubuğu = 100 μm. NFL dağınık bir desen gösterir. Nadir hücreler apoptotik belirteç aCASP3 için pozitiftir (İç kısım: 1-2-3). (B) Farklı zaman noktalarında dilimler halinde apoptoz oranının analizi. Ortalama ± SD, N (replikasyonlar) = 6 dilim, n (toplam hücre) > her dilim için 1.000, Kruskal-Wallis testi, çoklu karşılaştırma, p-değeri > 0.05. Apoptotik oran zamanla stabildir. Panel A'nın 1-2-3 iç kısımlarında, aCASP3 için pozitif hücrelerin ayrıntılarını (kırmızı boyama, beyaz oklar) gözlemlemek mümkündür. Küçük kırmızı noktalar hücre kalıntılarını ve piknotik çekirdekleri etiketler. Ölçek çubuğu = 50 μm. (C) DEV 90'da SC dilimleri üzerinde gerçekleştirilen canlı/ölü tahlillerin temsili görüntüleri: metabolik olarak aktif hücreler Calcein ile yeşil renkle etiketlenirken, ölü ve hasarlı hücreler Sytox ile açık mavi (camgöbeği) ile etiketlenir. İki histogram, toplam hücre sayısında Calcein (solda) ve Sytox (sağda) için pozitif hücrelerin yüzdesini gösterir. Her iki ortalama ± SD için, N (replikatörler) = 6 dilim, n (toplam hücre) > her dilim için 1.000, Kruskal-Wallis testi, çoklu karşılaştırma, DEV 30 ve DEV 60 p-değeri = 0.018; DEV 30 ve DEV 90 p değeri = 0.027; DEV 60 ve DEV 90 p değeri > 0.99. Kısaltmalar: DEV = gün ex vivo; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; NFL = nörofilament hafif zincir; SC = omurilik; aCASP3 = aktif kaspaz-3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig05.jpg"> Şekil 5: Fare organotipik dilimlerine h-SC-NES hücre transplantasyonu. (A) Transplantasyon protokolünün temsili şeması. Hücreler, farklılaşmanın DIV 10'unda nöral öncüler olarak DEV 4 organotipik dilimlere nakledilir. (B) DPT 30'a kadar zaman içinde GFP eksprese eden h-SC-NES hücreleri ile nakledilen fare organotipik dilimlerinin temsili görüntüleri. Hücreler, GFP genini taşıyan bir lentiviral vektör ile dönüştürülür. Zaman içindeki GFP ekspresyonu, canlılıklarını ve dilim ortamına adaptasyonlarını doğrular. Ölçek çubuğu = 500 μm. Kısaltmalar: DIV = ön türevdeki ilk gün; h-SC-NES = insan omuriliğinden türetilmiş nöroepitel sapı; GFP = yeşil floresan proteini; DEV = gün ex vivo; OM = organotipik ortam; GM = greft ortamı; DPT = nakilden sonraki günler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig06.jpg"> Şekil 6: Nakilden 30 gün sonra nakledilen h-SC-NES hücrelerinin apoptoz hızı değerlendirmesi. (A) GFP eksprese eden h-SC-NES hücreleri ile nakledilen bir fare organotipik diliminin temsili görüntüsü. Hücreler, transplantasyondan sonra dilimlere izlenmesi için GFP genini taşıyan bir lentiviral vektör ile dönüştürülür. Zaman içindeki GFP ekspresyonu, canlılıklarını ve dilim ortamına adaptasyonlarını doğrular. Gösterilen zaman noktası DPT 30'dur; hücreler insan çekirdeği (camgöbeği) ve aCASP3 (kırmızı) için boyanır. Ölçek Çubuğu = 150 μm. (B) Solda, DPT 30'da dilimler halinde nakledilen hücrelerin apoptoz analizinin temsili pasta grafiği (N (çoğaltır) = 5 dilim, n (hücreler) = 5.000) ve sağda, Hu-Nu+ hücrelerinin bir iç kısmı ve aCASP3'e pozitif bir hücrenin ayrıntısı (beyaz ok). Ölçek çubuğu = 75 μm. Küçük kırmızı noktalar hücre kalıntılarını ve piknotik çekirdekleri etiketler. Kısaltmalar: h-SC-NES = insan omuriliğinden türetilmiş nöroepitel sapı; GFP = yeşil floresan proteini; DPT = nakil sonrası gün; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; NFL = nörofilament hafif zincir; aCASP3 = aktif kaspaz-3; Hu-Nu = insan çekirdeği. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 1: Bu protokolde kullanılan çözeltilerin bileşimi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704_Tables%20of%20Solutions%20rev.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Long-Term Spinal Cord Slice Culture for Advancing Spinal Cord Regeneration Therapies at JoVE.com

Bu yazıda, hücresel replasman tedavilerini test etmek için ex vivo bir model olarak nöral kök hücrelerle nakledilen uzun süreli omurilik organotipik dilimleri oluşturmak ve sürdürmek için tekrarlanabilir bir yöntem sunuyoruz.

Resolutive cures for spinal cord injuries (SCIs) are still lacking, due to the complex pathophysiology. One of the most promising regenerative approaches ...

Omurilik yaralanmalarını ele almak için umut verici bir rejeneratif yaklaşım geliştirmekle ilgileniyoruz. Bu yazıda, omurilik araştırmalarında hücresel replasman tedavilerini test etmek için omurilik organotipik modelini doğruladık. Şimdiye kadar, omurilik organotipik modeller in vitro olarak iki veya üç hafta kültürde tutulmaktadır.Ve alt kültür ortamı, nöral kök hücre aşılaması, farklılaşması ve olgunlaşması için yetersizdir. Hücre replasman tedavileri, aşılanmış hücrelerin kayıp devreleri yeniden oluşturma yeteneğini duyurmak için hala iyileştirmeyi gerektirir. Bu protokol aracılığıyla, aşılanmış nöral kök hücrelerin hayatta kalması, entegrasyonu ve olgunlaşma hızı gibi hücre nakli ile ilgili sorunları ele almak için yeni, uzun vadeli bir ex vivo platform sağlıyoruz.Bu platform, araştırmacıların hücre nakli için en iyi stratejiyi bulmalarına yardımcı olacak ve in vivo doğrulama için gereken hayvan sayısını azaltacaktır. Protokolümüz, kavram kanıtı ve optimizasyon çalışmalarını gerçekleştirmek için basit, hızlı ve uygun maliyetlidir.

long-term-mouse-spinal-cord-organotypic-slice-culture-as-platform-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Long-Term Mouse Spinal Cord Organotypic Slice Culture as a Platform for Validating Cell Transplantation in Spinal Cord Injury

689 Görüntüleme.  University of Pisa. Omurilik yaralanmalarını ele almak için umut verici bir rejeneratif yaklaşım geliştirmekle ilgileniyoruz. Bu yazıda, omurilik araştırmalarında hücresel replasman tedavilerini test etmek için omurilik organotipik modelini doğruladık. Şimdiye kadar, omurilik organotipik modeller in vitro olarak iki veya üç hafta kültürde tutulmaktadır.Ve alt kültür ortamı, nöral kök hücre aşılaması, farklılaşması ve olgunlaşması için yetersizdir. Hücre replasman tedavi...