تم دعم الدراسة من قبل مؤسسة Wings for Life (WFL-IT- 20/21) ، وخطة الاتحاد الأوروبي للتعافي والمرونة الوطنية للاتحاد الأوروبي (NRRP) - المهمة 4 المكون 2 ، والاستثمار رقم 1.4-CUP N. B83C22003930001 (النظام البيئي الصحي في توسكانا - THE ، Spoke 8) ، ومارينا رومولي أونلوس. تعكس هذه المخطوطة وجهات نظر المؤلفين وآرائهم فقط، ولا يمكن اعتبار الاتحاد الأوروبي أو المفوضية الأوروبية مسؤولين عنها. تتوفر البيانات والبيانات الوصفية على Zenodo 10.5281 / zenodo.10433147. تم إنشاء الصور باستخدام Biorender https://www.biorender.com/.

تطعيم طويل الأمد لخلايا h-SC-NES في مزارع النمط العضوي للحبل الشوكي

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

لا يوجد حتى الآن علاج فعال للمرضى الذين يعانون من اصابات النخاع الشوكي. تم اختبار مناهج مختلفة وأحد أكثرها واعدة يعتمد على استبدال الخلايا الإستراتيجية المتجددة. في الوقت الحالي ، تتطلب التطورات في مجال الطب التجديدي منصات جديدة لاختبار فعالية وسلامة عمليات زرع الخلايا ، بمفردها أو بالاشتراك مع طرق أخرى. التحقق من صحتها قبل السريرية ضروري لمتابعة المزيد من الدراسات السريرية. تعد ثقافات النمط العضوي SC منصة مفيدة لدراسة الجوانب المختلفة للتنكس العصبي ، والتجديد العصبي ، والنمو العصبي ، وللتحقيق في فعالية الأساليب العلاجية الجديدة23. على وجه الخصوص ، تعد السمات المحددة للثقافات العضوية مثل الحفاظ على العمارة النسيجية الأصلية وتكوين الخلية والبيئة الدقيقة مفيدة لكشف ديناميكيات الزرع ، مثل نقش الخلايا والتكامل والتمايز والنضج.
تماشيا مع البروتوكولات المنشورة ، يمكن الحفاظ على شرائح النمط العضوي SC في الثقافة لمدة 2-3 أسابيع تقريبا في ظروف صحية ، مما يحد من استخدامها للتحقيقات طويلة الأجل والفحص الوظيفي المطلوب لاختبار مخططات العلاج الخلوي. يتطلب استكشاف العمليات المهمة مثل التمايز والنضج نحو المصير الصحيح للخلايا المزروعة داخل أنسجة SC مراقبة طويلة الأجل. هذه العمليات الخلوية حاسمة أثناء عمليات الزرع الشائعة في النماذج الحيوانية. إن توفر نظام خارج الجسم الحي يحاكي العديد من الميزات الموجودة في الجسم الحي سيكون مفيدا في مرحلة الفحص قبل السريري.
لهذا السبب ، في هذا العمل ، نقترح طريقة مثالية طويلة الأجل (≥30 يوما) للنمط العضوي SC تسمح بالحفاظ على شرائح SC قابلة للحياة لمدة تصل إلى 90 يوما ، مما يضاعف الإطار الزمني المعتاد للاستزراع ثلاث مرات. علاوة على ذلك ، نعرض نقشا مستقرا لخلايا h-SC-NES داخل شرائح SC والحفاظ على ثقافة الزرع لمدة تصل إلى 30 يوما. لقد راقبنا نقش الخلايا بمرور الوقت من خلال مراقبة تعبير GFP للتحقق من بقاء الخلية حتى DPT 30. بعد 30 DPT ، قمنا بتقييم معدل موت الخلايا المبرمج. في الأدبيات ، تم الإبلاغ عن تقييم موت الخلايا المبرمج لخلايا h-SC-NES المزروعة في شرائح SC عند 7 DPT40. هنا ، قمنا بتوسيع تحليل موت الخلايا المبرمج عند DPT 30 لمقارنة معدل موت الخلايا المبرمج فيما يتعلق بالنقطة الزمنية السابقة (DPT 7). اكتشفنا أن بياناتنا تتماشى مع الأدبيات ، مما يشير إلى أن خلايا h-SC-NES المزروعة تعيش أيضا في وقت لاحق إذا تم الحفاظ عليها في حالة الثقافة المحسنة في عملنا. ستساعد هذه المنصة المحسنة خارج الجسم الحي على المدى الطويل وحدها وفي تكوين الزرع الباحثين في الفحص قبل السريري لعمليات زرع الخلايا الجذعية لإصابات النخاع الشوكي. سيسمح لهم ذلك بتحديد أفضل خلية مرشحة لمزيد من الدراسات في الجسم الحي التي تعزز نجاح عمليات الزرع. علاوة على ذلك ، بعد الفحص الأولي ، يمكن أيضا استخدام شرائح النمط العضوي SC بالتوازي مع الدراسات في الجسم الحي لتأكيد وتأكيد الديناميات والسلوكيات الخلوية طويلة المدى التي لوحظت في النماذج الحيوانية أو لدعم الدراسات الآلية.
يصف بروتوكولنا بالتفصيل كيفية إنشاء هذا النموذج العضوي طويل المدى ، ولكن يجب أيضا مناقشة بعض الخطوات الحاسمة. فيما يتعلق بتوليد الثقافات العضوية SC ، هناك بعض التحديات أثناء الجراحة والمراحل الأولى من الثقافة. يعد إجراء الجراحة الذي يتم إجراؤه جيدا أمرا ضروريا لإنشاء شرائح تحافظ على العمارة النسيجية الأصلية. إذا تم تدمير SC أثناء العزل ، يمكن أن تفقد الشرائح هيكلها التشريحي النموذجي ويمكن أن يؤدي تلف الأنسجة إلى إهانة مفرطة مؤيدة للالتهابات تؤدي إلى ظروف غير صحية وموت الخلايا. المرحلة الأكثر تحديا أثناء الجراحة هي استخراج SC من العمود الفقري وإزالة السحايا من SC المعزول. يعتمد نجاح هذه الخطوات على خبرة المشغل ؛ لذلك ، يوصى بفترة تدريب قبل البدء في التجارب.
يعد التقسيم الإكليلي للجنة العليا من خلال المروحية أيضا مرحلة صعبة. يجب وضع SC المعزول على سطح القطع بشكل عمودي تماما على الشفرة. يجب على المشغل أيضا وضع الشفرة بشكل عمودي على سطح القطع. هذه الاحتياطات ضرورية لضمان توليد شرائح قابلة للتكرار بين نفس التجارب والتجارب المختلفة. قضية أخرى مهمة هي أن وقت الجراحة محدود: يجب أن يستغرق إجراء توليد الشرائح بالكامل ~ 30 دقيقة. إذا قضى المشغل وقتا أطول في الجراحة والقطع ، فستعاني أنسجة SC وهذا يمكن أن يضعف نجاح الثقافة والخطوات التالية للتجربة.
بمجرد وضع الشرائح على غشاء الثقافة ، من المهم إطعامها بشكل صحيح. GDNF ضروري للحفاظ على استعادة الأنسجة والبقاء على قيد الحياة. يعد القطع باستخدام المروحية أمرا مؤلما للأنسجة ، ولهذا السبب ، يتم وضع الشرائح بعد فترة وجيزة من القطع في وسط تشريح بارد لتنظيف الجزيئات الزائدة المؤيدة للالتهابات والمعززة للموت. بعد ذلك ، يتم وضع شرائح على أغشية المزرعة (إدخالات زراعة الخلايا) مع وسط جديد معدل باستخدام GDNF لتعزيز التعافي بشكل أسرع والتصاق الشرائح بالغشاء. يجب إضافة GDNF إلى الوسط كل يوم للأسبوع الأول في الثقافة بسبب عمر النصف القصير50,51. لاحظنا أن الشرائح تحتاج إلى الوجود المستمر ل GDNF خلال الأيام الأولى في الثقافة لتعزيز استعادة الأنسجة وصلاحيتها. على أي حال ، نظرا لأن وجود GDNF مهم لفترة الاستزراع بأكملها ، فلا ينصح بشدة بمقاطعة إدارة GDNF في نقاط زمنية أخرى.
خلال الأسبوع الأول في الثقافة ، من المهم أيضا فحص الشرائح مجهريا بالعين والمجهر. الأنسجة الشفافة وشفافية الحدود هي علامات على التصاق الشرائح بشكل صحيح بالغشاء والأنسجة القابلة للحياة. ستظهر الأنسجة الميتة بيضاء للغاية عند المنظر العياني الأول وستظهر المناطق الميتة رمادية داكنة عند المجهر. بعد بضعة أسابيع في الثقافة ، قد يتغير مورفولوجيا الأنسجة: يمكن أن تؤثر حركات الخلايا والتصاق الأنسجة بالغشاء على هذه العملية. لاحظنا ، على سبيل المثال ، فقدان التجويف المركزي في بعض الشرائح المملوءة بالخلايا وفقدان مورفولوجيا القرن الظهري والبطني. يحدث هذا بشكل أساسي مع شرائح أصغر ، في حين أن معظمها سيحافظ على بنية تشريحية قريبة من البنية الأصلية. عادة ما يتم إنشاء الشرائح من المناطق القطنية أو الصدرية لأنه بهذه الطريقة يمكن أن يكون لها الحجم المناسب للحفاظ على بنيتها النسيجية الأصلية بمرور الوقت: إذا كانت صغيرة جدا ، فإنها تفقد هندستها المعمارية بينما ، إذا كانت كبيرة جدا ، يمكن أن تتعرض المنطقة الوسطى للنخر. وبالتالي ، استخدمنا المنطقة القطنية لجراء الفئران لتوليد شرائح بالحجم المناسب للزراعة المثلى على المدى الطويل ، ولكن من حيث المبدأ ، يمكن اعتبار شرائح أخرى. علاوة على ذلك ، اخترنا استخدام المنطقة القطنية ، لأن المناطق البطنية والظهرية يمكن تمييزها عن بعضها البعض. بالإضافة إلى ذلك ، تقدم هذه المنطقة مناطق الأنسجة مع نسبة أعلى من الخلايا العصبية الحركية والمادة الرمادية ، والتي هي مواقع ذات أهمية لعلاجات استبدال الخلايا في اصابات النخاع الشوكي. فيما يتعلق بزرع الخلايا في الشرائح ، تتعلق المشكلة الرئيسية بكسر طرف الإبرة المجهرية الزجاجية. إذا كان ثقب مرور الخلايا كبيرا جدا ، فقد يتسبب ذلك في تلف أنسجة SC أثناء الحقن المجهري. إذا كانت صغيرة جدا ، يمكن أن يؤدي تكديس الخلايا إلى إعاقة الإبرة ، مما يعيق عملية الزرع. يجب إكمال عملية الزرع في غضون 1 ساعة لتقليل معاناة الخلايا وموتها.
يوفر البروتوكول المقترح أداة مثالية ومتعددة الاستخدامات لأنواع مختلفة من التحقيقات. هنا ، نطبق منصتنا طويلة المدى للتحقق من صحة زرع خلايا h-SC-NES في المراحل الأولى من التمايز داخل أنسجة SC للفأر لمدة 30 يوما. الجدة الرئيسية للنهج المقترح هي تحسين بروتوكول الثقافة المشتركة. تحافظ مكونات الكائنات المعدلة وراثيا على بقاء الخلايا العصبية على المدى الطويل لشرائح SC وخلايا h-SC-NES المزروعة. في الواقع ، فإن GM ، كونها وسيطا خاليا من المصل ، تحافظ على تمايز الخلايا المزروعة نحو مصير الخلايا العصبية فيما يتعلق بالوسط المستخدم سابقا لثقافة الشرائح العضوية47.
فيما يتعلق بالنماذج المقترحة ل SCI ، عادة ما يتم إجراء التجارب على الفئران البالغة. حتى الآن ، ترتبط أهم الاختلافات بين SC حديثي الولادة والبالغين بإمكانات التجدد الأعلى الموجودة في حديثي الولادة فيما يتعلق بالفئران البالغة52. ومع ذلك ، فإن مثل هذه الاختلافات ليس لها أي تأثير على نوع البروتوكول الذي نقترحه ، لأننا نركز هنا على استجابة الخلايا المطعمة لبيئة الأنسجة المضيفة بدلا من قدرات تجديد الخلايا العصبية المقيمة. هناك اختلاف آخر بين الفئران حديثي الولادة والبالغين بعد اصابات النخاع الشوكي يتعلق بتكوين الندبة الدبقية التي تحدث عند البالغين. لا يؤخذ هذا الجانب في الاعتبار في النموذج المقترح ، والذي لا يأخذ في الاعتبار العمليات الفسيولوجية المرضية المعقدة الناتجة عن الإصابات الأولية والثانوية.
فيما يتعلق بالتطبيقات ، يمكن أيضا استخدام المنصة للتحقيق في التكامل بين الخلايا المزروعة مع الدوائر المقيمة الموجودة في نموذج النمط العضوي SC. تم استخدام أدوات الهندسة الوراثية بالفعل في الجهاز العصبي المركزي لتقييم الاتصال المشبكي ويمكن استغلالها في هذا الصدد53،54،55. على وجه الخصوص ، يمكن التحقيق في التكامل والتحقق من صحته من خلال تقييم تكوين نقاط الاشتباك العصبي بين الخلايا المطعمة والأنسجة SC خارج الجسم الحي . يمكن أيضا استغلال هذه الثقافات العضوية طويلة المدى لاختبار عوامل الحماية العصبية والتجدد العصبي أو الجزيئات / المواد الجديدة أو لدراسة الاضطرابات التنكسية العصبية التي تنطوي على SC. لدراسة اضطرابات تنكسية عصبية محددة ، يجب تكييف البروتوكول لزراعة شرائح SC المتولدة من النماذج ذات الصلة ، مثل الفئران المعدلة وراثيا التي تحمل طفرات محددة مرتبطة بعلم الأمراض ، في المرحلة ذات الصلة لعلم الأمراض (أي حديثي الولادة والأحداث والبالغين). في الختام ، فإن بروتوكولنا وثقافاتنا العضوية بشكل عام ، كونها نباتات لعضو معين ، تقدم ميزات تسد الفجوة بين ثقافات الخلايا 2D والنماذج في الجسم الحي ، مما يؤكد أنها أداة لا تقدر بثمن لكل من البحوث الأساسية والاختبارات قبل السريرية.

إصابات الحبل الشوكي الرضحية (SCI) لها عواقب جسدية ونفسية واقتصادية مدمرة على المرضى ومقدمي الرعاية1. بذلت العديد من المحاولات لتعزيز تجديد المحور العصبي في اصابات النخاع الشوكي بطرق مختلفة2،3،4 وتم إثبات بعض الآثار المفيدة من خلال تكوين مرحلات عصبية بين الخلايا العصبية القريبة والبعيدة في موقع الإصابة من خلال علاجات استبدال الخلايا. لا يزال الاهتمام بالعلاجات الخلوية ينمو5 لأن الخلايا المزروعة يمكن أن تلعب العديد من الأدوار ، بما في ذلك توفير الدعم الغذائي ، والتعديل المناعي ، وتجديد الدوائر العصبية المفقودة من خلال تحريض اللدونة ، واستبدال الخلايا ، وإعادة الميالين المحوري6.
في الآونة الأخيرة ، ركز الجهد الرئيسي في هذا المجال على الخلايا الجذعية / السلفية العصبية البشرية (NSCs / NPCs) 7. تشير العديد من الدراسات إلى أن NSCs / NPCs تعدل استجابة الخلايا النجمية8 ، وتعزز إفراز عوامل التجدد 9,10 ، وتحل محل الخلايا العصبية المفقودة في SCI11,12. ومع ذلك ، فإن الدراسات التي تدعم تمايز الخلايا المزروعة إلى خلايا عصبية وظيفية لا تزال ضعيفة. علاوة على ذلك ، فإن بقاء الخلايا المزروعة والتمايز في الحبل الشوكي المصاب (SC) منخفض13 ، ربما لأن الخلايا المزروعة تستغرق عدة أسابيع ، وحتى أشهر ، للتمايز في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، لم توضح الدراسات الحالية بشكل كامل العديد من الجوانب البيوكيميائية والجزيئية والخلوية والوظيفية لعلاجات استبدال الخلايا. في هذا السياق ، هناك حاجة إلى نماذج بسيطة وسريعة وفعالة من حيث التكلفة لدراسة آليات تطعيم الخلايا ، وقدرة الخلايا المطعمة على التكاثر ، والتمايز إلى أنواع محددة أو مجموعات فرعية من الخلايا ، وتشكيل نقاط الاشتباك العصبي مع الخلايا العصبية المقيمة.
يعد دمج الدراسات النسيجية في التسجيل الفيزيولوجي الكهربي والتنميط النسخي والبروتيني ضروريا لفهم كامل للسلسلة الجزيئية التي تحدث بعد زرع الخلايا. سيؤدي هذا بالتأكيد إلى تسريع تصميم علاجات استبدال الخلايا الجديدة والتحقق من صحتها في النماذج قبل السريرية والدراسات السريرية. في الواقع ، حتى الآن ، كان استخدام القوارض الكبيرة والرئيسيات غير البشرية مفيدا لتوضيح العديد من العمليات الخلوية بعد الزرع14. ومع ذلك ، نظرا للتكلفة العالية ، والتأثير الأخلاقي العالي ، فضلا عن تعقيد الكائن الحي ، فإن استخدامها غالبا ما يكون غير مباشر أو غير كاف لكشف العمليات الكيميائية الحيوية والجزيئية. بالإضافة إلى ذلك ، قد يقدمون العديد من العيوب المرتبطة بالاختلافات البيولوجية ، سواء بين الأنواع (التمثيل الغذائي) أو التباين داخل الأنواع (الجنس ، العمر).  هذه العوامل ، جنبا إلى جنب مع العوامل الخارجية مثل المواقف العصيبة ، يمكن أن تغير نتائج التجربة وإمكانية التنبؤ بها من حيث الترجمة العلاجية للبشر15،16،17.
وبالتالي ، فإن العديد من المجموعات تستخدم 2D في زراعة الخلايا المختبرية وشرائح النمط العضوي خارج الجسم الحي (الثقافات خارج الجسم الحي) بالإضافة إلى النماذج الحيوانية. ثقافة الخلايا 2D هي النظام الأكثر استخداما لدراسة عمليات بيولوجية محددة على مستوى خلية واحدة و / أو خلية السكان. ومع ذلك ، فإن ثقافات الخلايا أحادية الطبقة لا تعكس التعقيد الموجود في الكائن الحي بأكمله. لا يسمح نقص هياكل الأنسجة والبيئة الفسيولوجية لأنظمة الثقافة ثنائية الأبعاد بمحاكاة الجوانب الهيكلية والمورفولوجية والوظيفية الرئيسية للأنسجة التي تم التحقيق فيها18،19،20. يمكن للثقافات العضوية التغلب على بعض هذه القضايا. تعتمد نماذج النمط العضوي على زرع جزء من نسيج أو عضو والحفاظ عليه خارج الجسم الحي لفترة محدودة21,22. على وجه الخصوص ، يتم إنشاء شرائح من الأنسجة المزروعة بسمك دقيق يسمح للمغذيات بالوصول بسهولة إلى جميع الخلايا الموجودة في الشرائح تقريبا. يمكن أن تتولد من مناطق مختلفة من الجهاز العصبي المركزي ، مثل الحصين ، ما تحت المهاد ، المخيخ ، المهاد ، القشرة الدماغية ، المادة السوداء والمخطط ، والحبل الشوكي23. تحتفظ الثقافات العضوية ببنية الأنسجة ، والتوزيع المكاني للخلايا ، والتنوع الخلوي ، والبيئة (أي تكوين المصفوفة خارج الخلية) للعضو الأصلي. علاوة على ذلك ، فإنها تحافظ على النشاط العصبي الأصلي ، والوصلات بين الخلايا ، وعلى وجه الخصوص ، الدوائر قصيرة المسافات بعد الزرع.
توفر هذه الجوانب بعض المزايا للثقافات خارج الجسم الحي فيما يتعلق بكل من الثقافات أحادية الطبقة والنماذج الحيوانية. يحتفظون بميزات الأنسجة الرئيسية الموجودة في الجسم الحي ولكن مع تقليل التكاليف وإمكانية إجراء أنواع مختلفة من التجارب الجزيئية والخلوية والوظيفية مع تنظيم دقيق للمعلمات البيئية للثقافة24،25،26،27،28،29. يمكن أيضا استغلال شرائح النمط العضوي لتطوير نماذج للاضطرابات العصبية المختلفة من خلال تشبه السمات النسيجية المرضية الرئيسية لحالات معينة30. علاوة على ذلك ، فإن الاحتفاظ ببيئة الأنسجة الأصلية متعددة الخلايا يجعلها منصات مناسبة لفحص الأدوية واختبار الجزيئات والمواد العصبية والتجديدية العصبية.
في هذا العمل ، نقترح استخدام ثقافات النمط العضوي SC كنموذج لتحسين عمليات زرع NSC. هذا ليس تافها لأن ظروف الاستزراع المثلى مطلوبة لضمان بقاء كل من المضيف (أنسجة SC) والزرع (NSCs) لأسابيع. مجموعات بحثية مختلفة منخرطة في ثقافات النمط العضوي ، مشتقة من الدماغ ومشتقة من SC ، أنواع مختلفة من الخلايا. أظهرت معظم الأعمال زرع الخلايا الجذعية الوسيطة31،32،33 ، أو خلايا التغليف الشمي34 ، أو NSCs35،36،37،38،39،40 وتقييم تفاعلات الخلايا المطعمة مع الخلايا المضيفة ، وبقاء النظام بأكمله ، وما إذا كانت الخلايا المزروعة متمايزة إلى خلايا عصبية أو خلايا شبيهة بالخلايا العصبية داخل بيئة الأنسجة خارج الجسم الحي 32،33،41. قام بعضهم بتقييم الإمكانات التجديدية للخلايا بعد الزرع ، ومراقبة نموها المحوري داخل الأنسجة37،40،41 ، والقدرة الميالينية للسلائف المطعمة من oligodendrocytes42 ، وهجرة الخلايا المطعمة إلى النسيج المضيف43 ، وما إذا كانت الخلايا المزروعة تطلق عوامل تدفع نحو بيئة التجدد31. أحد قيود الدراسات الحالية هو أنها لا تستكشف النقش لفترة طويلة الأجل.
بالنظر إلى أن NSCs يبدو أنها تتطلب عدة أسابيع للتمييز في الجسم الحي44,45 ، تركز هذه الدراسة على كيفية إنشاء وصيانة شرائح SC للفأر على المدى الطويل (≥30 يوما) لمدة تصل إلى 90 يوما. تم العثور على شرائح للاحتفاظ بهيكلها التشريحي الأصلي والحفاظ على معدل موت الخلايا المبرمج منخفض ومستقر بمرور الوقت وقابلية عالية للخلية. لاحظنا تعبيرا منتشرا عن علامات الحمض النووي الريبي المرتبطة ب fox-1 homolog 3 (RBFOX3) وسلسلة ضوء الخيوط العصبية (NFL) ، حيث أظهر الأخير اتجاها متزايدا للنبتات المحورية حول الشرائح بمرور الوقت ، مما يشهد على حالتها الصحية. علاوة على ذلك ، نجحنا في زرع الخلايا الجذعية العصبية الظهارية البشرية المشتقة من SC (h-SC-NES) في المراحل الأولى من التمايز العصبي في شرائح SC التي تعبر عن GFP في المراحل الأولى من التمايز العصبي. تم الحفاظ على طعم NSC لمدة 30 يوما بعد الزرع وأظهرت الخلايا تعبير GFP طوال الفترة في الثقافة. كما وجد أن معدل موت الخلايا المبرمج للخلايا في اليوم التالي للزرع (DPT) 30 يتماشى مع قيمة معدل موت الخلايا المبرمج التي لوحظت في DPT 7 في نفس الخلايا40. بدا أن الخلايا تنغمس في بيئة الأنسجة وبقيت على قيد الحياة لعدة أسابيع.
باختصار ، توضح بياناتنا أنه من الممكن الحفاظ على شرائح النمط العضوي SC في الثقافة لمدة 3 أشهر دون المساس ببنيتها الخلوية الأصلية وبيئة الأنسجة. الأهم من ذلك ، يمكن استغلالها لاختبار العلاجات الخلوية قبل الشروع في تجربة في الجسم الحي ، وبالتالي تقليل التكاليف والوقت التجريبي. هنا ، نوضح بالتفصيل جميع الممرات لإنشاء شرائح النمط العضوي SC الماوس وكيفية الحفاظ عليها لفترات طويلة الأجل (≥30 يوما). علاوة على ذلك ، نوضح بعمق كيفية إجراء زرع NPC في الشرائح وكيفية الحفاظ عليها لتحليل المصب.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-cleaved Caspase-3,&#160; (Asp175) (5A1E) (Rabbit)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9661S</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP (Mouse) - monoclonal</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>G6539</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Human Nuclei (Mouse) - monoclonal, clone 235-1&#160;</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>MAB1281</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Human Nuclei (Rabbit)</td>
			<td>NeoBiotechnologies</td>
			<td>RBM5-346-P1</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NeuN (RBFOX3) (Rabbit) - polyclonal</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>ABN78</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NFL (Mouse)</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>MAB1615</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NFL H-Phospho (Rabbit) -polyclonal</td>
			<td>Biologend</td>
			<td>840801</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Polymount</td>
			<td>Poly-sciences</td>
			<td>18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC7074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>118364227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture graded water</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>W3500-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from rat tail</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>C7661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope - A1 Confocal Microscope (Eclipse Ti)</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>gf144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-2</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>03-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>SRP3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries, 3.5&#34;&#160;</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti Mouse IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti Mouse IgG Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21236</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti Rabbit IgG Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11011</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti Rabbit IgG Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21244</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph Pad-Prism</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td></td>
			<td>Software for Statistical Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-050</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral prep</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>17446-LV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L32250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11090-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>to load cells in the needle for transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell cell culture membrane</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscroscope cover glasses</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>ECN 631-1572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (35mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pasteur pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1171.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV830</td>
			<td>Microinjector for transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>SWAN3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle #3</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope for imaging and acquisition</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope for surgery</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers-Dumont #5-inox</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Scissors, 8.5 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical micropipette puller</td>
			<td>Shutter Instrument</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254/50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term mouse spinal cord organotypic slice culture as a platform for validating cell transplantation in spinal cord injury

لا تزال العلاجات الحلولية لإصابات الحبل الشوكي (SCIs) غير موجودة ، بسبب الفيزيولوجيا المرضية المعقدة. يعتمد أحد أكثر الأساليب التجديدية الواعدة على زرع الخلايا الجذعية لاستبدال الأنسجة المفقودة وتعزيز الانتعاش الوظيفي. يجب مواصلة استكشاف هذا النهج بشكل أفضل في المختبر وخارج الجسم الحي من أجل السلامة والفعالية قبل الشروع في إجراء اختبارات حيوانية أكثر تكلفة واستهلاكا للوقت. في هذا العمل ، نظهر إنشاء منصة طويلة الأجل تعتمد على شرائح النمط العضوي للحبل الشوكي للفأر (SC) المزروعة بالخلايا الجذعية العصبية البشرية لاختبار علاجات الاستبدال الخلوي لإصابات النخاع الشوكي.
يتم الحفاظ على الثقافات العضوية القياسية SC لمدة 2 أو 3 أسابيع في المختبر. هنا ، نصف بروتوكولا محسنا للصيانة طويلة الأجل (≥ 30 يوما) لمدة تصل إلى 90 يوما. كما تم تحسين الوسط المستخدم لزراعة شرائح SC على المدى الطويل لزرع الخلايا الجذعية العصبية في نموذج النمط العضوي. تم زرع الخلايا الجذعية العصبية الظهارية المشتقة من SC (h-SC-NES) التي تحمل مراسل بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) في شرائح SC للفئران. بعد ثلاثين يوما من عملية الزرع ، لا تزال الخلايا تظهر تعبير GFP ومعدل موت الخلايا المبرمج المنخفض ، مما يشير إلى أن البيئة المثلى حافظت على بقائها وتكاملها داخل الأنسجة. يمثل هذا البروتوكول مرجعا قويا لاختبار علاجات استبدال الخلايا بكفاءة في أنسجة SC. ستسمح هذه المنصة للباحثين بإجراء فحص مسبق خارج الجسم الحي لعلاجات زرع الخلايا المختلفة ، مما يساعدهم على اختيار الإستراتيجية الأنسب قبل الشروع في التجارب في الجسم الحي .

Traumatic spinal cord injury (SCI) has devastating physical, psychological, and economic consequences for patients and caregivers1. Many attempts have been made to promote axonal regeneration in SCI with different approaches2,3,4 and some beneficial effects were demonstrated by the formation of neuronal relays between proximal and distal neurons in the injury site through cell replacement therapies. The interest in cell therapies is still growing5 since transplanted cells can play many roles, including providing trophic support, immune modulation, regenerating lost neural circuits through induction of plasticity, cell replacement, and axon remyelination6.
Recently, the main effort in the field focused on human neural stem/progenitor cells (NSCs/NPCs)7. Several studies suggest that NSCs/NPCs modulate astrocyte response8, promote the secretion of proregenerative factors9,10, and replace missing neuronal cells in SCI11,12. However, studies that support the differentiation of transplanted cells into functional neurons are still poor. Moreover, transplanted cell survival and differentiation in the injured spinal cord (SC) are low13, possibly because transplanted cells take several weeks, even months, to differentiate in vivo. Additionally, current studies have not completely elucidated many biochemical, molecular, cellular, and functional aspects of cell replacement therapies. In this context, simple, fast, and cost-effective models are required to study the mechanisms of cell engraftment, the ability of engrafted cells to proliferate, differentiate into specific types or subpopulations of cells, and form synapses with resident neurons.
Integrating histological studies into electrophysiological recording and transcriptome and proteome profiling is necessary for a full comprehension of the molecular cascade occurring after cell transplantation. This certainly will speed up the design and validation of new cell replacement therapies in preclinical models and clinical studies. Indeed, to date, the use of rodents, large animals, and non-human primates has been worthwhile for elucidating many cellular processes after transplantation14. However, due to the high cost, the high ethical impact, as well as the complexity of the organism, their use is often not straightforward or not adequate to unravel biochemical and molecular processes. In addition, they may present many disadvantages correlated with biological differences, both interspecies (metabolism) and intraspecies variability (sex, age).&#160;&#160;These factors, together with external factors such as stressful situations, could alter the outcome of an experiment and their predictability in terms of therapeutic translation to humans15,16,17.
Thus, many groups employ 2D in vitro cell culture and ex vivo organotypic slices (ex vivo cultures) in addition to animal models. 2D cell culture is the most commonly used system for studying specific biological processes at a single-cell and/or cell population level. Nevertheless, monolayer cell cultures do not reflect the complexity found in a whole organism. The lack of tissue structures and&#160;physiological environment does not allow the 2D culture systems to completely emulate key structural, morphological, and functional aspects of the investigated tissue18,19,20. Organotypic cultures can overcome some of these issues. Organotypic models are based on explanting a fragment of a tissue or organ and maintaining it ex vivo for a limited period21,22. In particular, slices of the explanted tissue are generated with a precise thickness that allows nutrients to easily reach almost all the cells in the slices. They&#160;can be generated from various regions of the central nervous system, such as the hippocampus, hypothalamus, cerebellum, thalamus, cerebral cortex, substantia nigra and striatum, and spinal cord23. Organotypic cultures retain the tissue architecture, the spatial distribution of cells, the cellular diversity, and the environment (i.e., extracellular matrix composition) of the organ of origin. Moreover, they preserve the original neural activity, connections between cells, and in particular, short-distance circuits after the explant.
These aspects provide some advantages for ex vivo cultures with respect to both monolayer cultures and animal models. They retain key tissue features found in vivo but with the reduction of the costs and the possibility to perform different types of molecular, cellular, and functional experiments with an accurate regulation of the culture environmental parameters24,25,26,27,28,29. Organotypic slices can also be exploited to develop models for different neurological disorders by resembling key histopathological features of specific conditions30. Moreover, the retention of the original multicellular tissue environment renders them appropriate platforms for drug screening and for testing neuroprotective and neuro-regenerative molecules and materials.
In this work, we propose the use of SC organotypic cultures as a model to optimize NSC transplants. This is not trivial since optimal culturing conditions are required to guarantee the survival of both the host (SC tissue) and the transplant (NSCs) for weeks. Different research groups engrafted in organotypic cultures, brain-derived and SC-derived, various types of cells. Most of the works showed the transplantation of mesenchymal stem cells31,32,33, olfactory ensheathing cells34, or NSCs35,36,37,38,39,40 and evaluated the interactions of engrafted cells with the host cells, the survival of the whole system, and whether the transplanted cells differentiated into neurons or neuron-like cells inside the ex vivo tissue environment32,33,41. Some of them evaluated the regenerative potential of cells after transplant, observing their axonal growth inside the tissue37,40,41, the myelinating ability of engrafted precursors of oligodendrocytes42, the migration of engrafted cells into the host tissue43, and whether the transplanted cells released factors pushing towards a proregenerative environment31. One limitation of the current studies is that they do not explore the engraftment for a long-term period.
Considering that NSCs seem to require several weeks to differentiate in vivo44,45, this study focuses on how to generate and maintain long-term (&#8805;30 days) mouse SC slices for up to 90 days. Slices were found to retain their original anatomical structure and to maintain a low and stable apoptotic rate over time and high cell viability. We observed diffuse expression of neuronal markers RNA binding fox-1 homolog 3 (RBFOX3) and neurofilament light chain (NFL), with the latter showing an increasing trend of axonal sprouting around the slices over time, attesting to their healthy condition. Moreover, we successfully transplanted into the SC-slices GFP-expressing human SC-derived neuroepithelial stem (h-SC-NES) cells at the first stages of neuronal differentiation. The NSC graft was maintained for 30 days after transplant and cells showed GFP expression for all the period in culture. The apoptotic rate of cells at day post-transplant (DPT) 30 was also found to be in line with respect to the apoptotic rate value observed at DPT 7 in the same cells40. Cells seemed to engraft into the tissue environment and survived up to several weeks.
In summary, our data demonstrate that it is possible to maintain in culture SC organotypic slices for 3 months without compromising their original cytoarchitecture and the tissue environment. Most importantly, they can be exploited to test cell therapies before proceeding with an in vivo experiment, thus reducing the costs and the experimental time. Here, we illustrate in detail all the passages to generate mouse SC organotypic slices and how to maintain them for long-term periods (&#8805;30 days). Moreover, we deeply explain how to perform NPC transplantation into the slices and how to maintain them for downstream analysis.

تسليط الضوء على المؤلف: ثقافة شريحة الحبل الشوكي على المدى الطويل لتطوير علاجات تجديد الحبل الشوكي

ثقافة شريحة النمط العضوي للحبل الشوكي للفأر على المدى الطويل كمنصة للتحقق من صحة زرع الخلايا في إصابة الحبل الشوكي

We are interested in developing a promising regenerative approach to address spinal cord injuries. In this paper, we validate spinal cord organotypic model for testing cellular replacement therapies in spinal cord research. So far, spinal cord organotypic models are maintained in culture for two or three weeks in vitro.And subculture media are suboptimal for neural stem cell engraftment, differentiation, and maturation. Cell replacement therapies still require the improvement to announce the ability of the grafted cells to reconstitute the lost circuits. Through this protocol, we provide a novel, long-term ex vivo platform to tackle cell transplant related issue like survival, integration, and maturation rate of the engrafted neural stem cells.This platform will be helpful for researchers to find the best strategy for cell transplantation, reducing the number of animals required for in vivo validation. Our protocol is simple, fast, and cost-effective to perform proof of concept and optimization studies.

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Long-Term Spinal Cord Slice Culture for Advancing Spinal Cord Regeneration Therapies at JoVE.com

في هذه الورقة ، نقدم طريقة قابلة للتكرار لتوليد والحفاظ على شرائح النمط العضوي للحبل الشوكي على المدى الطويل المزروعة بالخلايا الجذعية العصبية كنموذج خارج الجسم الحي لاختبار علاجات الاستبدال الخلوي.

Resolutive cures for spinal cord injuries (SCIs) are still lacking, due to the complex pathophysiology. One of the most promising regenerative approaches ...

نحن مهتمون بتطوير نهج تجديدي واعد لمعالجة إصابات الحبل الشوكي. في هذه الورقة ، نتحقق من صحة نموذج النمط العضوي للحبل الشوكي لاختبار علاجات الاستبدال الخلوي في أبحاث الحبل الشوكي. حتى الآن ، يتم الحفاظ على نماذج النمط العضوي للحبل الشوكي في الثقافة لمدة أسبوعين أو ثلاثة أسابيع في المختبر.ووسائط الاستزراع الفرعي دون المستوى الأمثل لتطعيم الخلايا الجذعية العصبية والتمايز والنضج. لا تزال علاجات استبدال الخلايا تتطلب التحسين للإعلان عن قدرة الخلايا المطعمة على إعادة تكوين الدوائر المفقودة. من خلال هذا البروتوكول ، نقدم منصة جديدة وطويلة الأجل خارج الجسم الحي لمعالجة المشكلات المتعلقة بزراعة الخلايا مثل البقاء على قيد الحياة والتكامل ومعدل نضج الخلايا الجذعية العصبية المطعمة.ستكون هذه المنصة مفيدة للباحثين لإيجاد أفضل استراتيجية لزراعة الخلايا ، مما يقلل من عدد المطلوبة للتحقق من الصحة في الجسم الحي. بروتوكولنا بسيط وسريع وفعال من حيث التكلفة لإجراء دراسات إثبات المفهوم والتحسين.

long-term-mouse-spinal-cord-organotypic-slice-culture-as-platform-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Long-Term Mouse Spinal Cord Organotypic Slice Culture as a Platform for Validating Cell Transplantation in Spinal Cord Injury

709 Views.  University of Pisa. نحن مهتمون بتطوير نهج تجديدي واعد لمعالجة إصابات الحبل الشوكي. في هذه الورقة ، نتحقق من صحة نموذج النمط العضوي للحبل الشوكي لاختبار علاجات الاستبدال الخلوي في أبحاث الحبل الشوكي. حتى الآن ، يتم الحفاظ على نماذج النمط العضوي للحبل الشوكي في الثقافة لمدة أسبوعين أو ثلاثة أسا...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: ثقافة شريحة الحبل الشوكي على المدى الطويل لتطوير علاجات تجديد الحبل الشوكي

Resolutive cures for spinal cord injuries (SCIs) are still lacking, due to the complex pathophysiology. One of the most promising regenerative approaches is based on stem cell transplantation to replace lost tissue and promote functional recovery. This approach should be further explored better in vitro and ex vivo for safety and efficacy before proceeding with more expensive and time-consuming animal testing. In this work, we show the establishment of a long-term platform based on mouse spinal cord (SC) organotypic slices transplanted with human neural stem cells to test cellular replacement therapies for SCIs.
Standard SC organotypic cultures are maintained for around 2 or 3 weeks in vitro. Here, we describe an optimized protocol for long-term maintenance (&#8805;30 days) for up to 90 days. The medium used for long-term culturing of SC slices was also optimized for transplanting neural stem cells into the organotypic model. Human SC-derived neuroepithelial stem (h-SC-NES) cells carrying a green fluorescent protein (GFP) reporter were transplanted into mouse SC slices. Thirty days after the transplant, cells still show GFP expression and a low apoptotic rate, suggesting that the optimized environment sustained their survival and integration inside the tissue. This protocol represents a robust reference for efficiently testing cell replacement therapies in the SC tissue. This platform will allow researchers to perform an ex vivo pre-screening of different cell transplantation therapies, helping them to choose the most appropriate strategy before proceeding with in vivo experiments.

In this paper, we provide a reproducible method to generate and maintain long-term spinal cord organotypic slices transplanted with neural stem cells as an ex vivo model for testing cellular replacement therapies.