המחקר נתמך על ידי קרן Wings for Life (WFL-IT- 20/21), תוכנית ההתאוששות והחוסן הלאומית של האיחוד האירופי מהדור הבא (NRRP)-משימה 4 רכיב 2, השקעה n. 1.4-CUP N. B83C22003930001 (Tuscany Health Ecosystem-THE, Spoke 8), ומרינה רומולי אונלוס. כתב יד זה משקף רק את השקפותיהם ודעותיהם של המחברים, לא האיחוד האירופי ולא הנציבות האירופית יכולים להיחשב אחראים להם. נתונים ומטה-נתונים זמינים ב-Zenodo 10.5281/zenodo.10433147. התמונות נוצרו באמצעות Biorender https://www.biorender.com/.

השתלה ארוכת טווח של תאי h-SC-NES בתרביות אורגנוטיפיות של חוט השדרה

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

עדיין אין טיפול יעיל לחולים עם SCI. גישות שונות נבדקו ואחת המבטיחות ביותר מבוססת על החלפת תאי אסטרטגיה רגנרטיבית. כיום, ההתקדמות בתחום הרפואה הרגנרטיבית מבקשת פלטפורמות חדשניות לבדיקת היעילות והבטיחות של השתלות תאים, לבד או בשילוב עם גישות אחרות. האימות הפרה-קליני שלהם חיוני כדי להמשיך במחקרים קליניים נוספים. תרביות אורגנוטיפיות של SC הן פלטפורמה שימושית לחקר היבטים שונים של ניוון עצבי, התחדשות עצבית והתפתחות עצבית, ולחקירת יעילותן של גישות טיפוליות חדשניות23. בפרט, מאפיינים ספציפיים של תרבויות אורגנוטיפיות כגון שמירה על היסטוארכיטקטורה מקורית והרכב תאים ומיקרו-סביבה הם יתרון לפענוח דינמיקת השתלות, כגון קליטת תאים, אינטגרציה, התמיינות והתבגרות.
באופן עקבי עם פרוטוקולים שפורסמו, פרוסות אורגנוטיפיות SC יכולות להישמר בתרבית במשך כ 2-3 שבועות בתנאים בריאים, מה שמגביל את השימוש בהן לחקירות ארוכות טווח וסינון פונקציונלי הנדרש לתוכניות בדיקה של טיפול תאי. חקירת תהליכים חשובים כגון התמיינות והבשלה לקראת גורלם הנכון של תאים מושתלים בתוך רקמת SC דורשת ניטור ארוך טווח. תהליכים תאיים אלה הם קריטיים במהלך השתלות נפוצות במודלים של בעלי חיים. הזמינות של מערכת ex vivo המחקה תכונות רבות הקיימות in vivo תהיה מועילה בשלב הסינון הפרה-קליני.
מסיבה זו, בעבודה זו, אנו מציעים שיטת תרבות אורגנוטיפית אופטימלית לטווח ארוך (≥30 יום) SC המאפשרת לשמור על פרוסות SC קיימא עד 90 יום, תוך שילוש מסגרת הזמן הרגילה שלהם בתרבית. יתר על כן, אנו מראים קליטה יציבה של תאי h-SC-NES בתוך פרוסות SC ושמירה על תרבית ההשתלה למשך עד 30 יום. עקבנו אחר קליטת התאים לאורך זמן על ידי התבוננות בביטוי GFP כדי לאמת את הישרדות התאים עד DPT 30. לאחר 30 DPT, הערכנו את קצב אפופטוזיס התא. בספרות, הערכה של אפופטוזיס של תאי h-SC-NES מושתלים בפרוסות SC ב 7 DPT דווח40. כאן, הרחבנו את ניתוח אפופטוזיס התא ב- DPT 30 כדי להשוות את קצב האפופטוטי ביחס לנקודת הזמן הקודמת (DPT 7). גילינו שהנתונים שלנו עולים בקנה אחד עם הספרות, מה שמצביע על כך שתאי h-SC-NES מושתלים שורדים גם בנקודת זמן מאוחרת יותר אם הם נשמרים בתנאי התרבית האופטימליים בעבודתנו. פלטפורמת ex vivo משופרת זו לטווח ארוך לבדה ובתצורת ההשתלה תסייע לחוקרים בבדיקות פרה-קליניות להשתלות מבוססות תאי גזע עבור SCI. זה יאפשר להם לזהות את המועמד הטוב ביותר לתאים למחקרי in vivo נוספים המקדמים את הצלחת ההשתלות. יתר על כן, לאחר סינון ראשוני, פרוסות אורגנוטיפיות SC יכולות לשמש גם במקביל למחקרי in vivo כדי לאשר ולאמת דינמיקה תאית ארוכת טווח והתנהגויות שנצפו במודלים של בעלי חיים או לתמוך במחקרים מכניסטיים.
הפרוטוקול שלנו מתאר בפירוט כיצד ליצור מודל אורגנוטיפי ארוך טווח זה, אך יש לדון גם בכמה צעדים קריטיים. לגבי הדור של תרבויות אורגנוטיפיות SC, ישנם כמה אתגרים במהלך הניתוח ואת השלבים הראשונים של התרבות. הליך ניתוח המבוצע היטב חיוני ליצירת פרוסות השומרות על ההיסטוארכיטקטורה המקורית. אם SC נהרס במהלך הבידוד, פרוסות יכולות לאבד את המבנה האנטומי האופייני שלהן ונזק לרקמות יכול לגרום לעלבון פרו-דלקתי מוגזם המוביל לתנאים לא בריאים ומוות תאי. השלב המאתגר ביותר במהלך הניתוח הוא עקירת ה-SC מעמוד השדרה והסרת קרומי המוח מה-SC המבודד. ההצלחה של צעדים אלה תלויה בניסיון של המפעיל; לכן, מומלץ תקופת הכשרה לפני תחילת הניסויים.
חתך קורונלי של SC באמצעות מסוק הוא גם שלב מאתגר. את ה-SC המבודד יש למקם על סיפון החיתוך בדיוק בניצב ללהב. המפעיל צריך גם למקם את הלהב בניצב לסיפון החיתוך. אמצעי זהירות אלה נחוצים כדי להבטיח את הדור של פרוסות לשחזור בין ניסויים זהים ושונים. נושא חשוב נוסף הוא שזמן הניתוח מוגבל: כל הליך יצירת הפרוסה חייב להימשך ~30 דקות. אם המפעיל משקיע זמן רב יותר בניתוח וחיתוך, רקמת SC תסבול וזה יכול לפגוע בהצלחת התרבית ובשלבים הבאים של הניסוי.
לאחר שמניחים פרוסות על קרום התרבית, חשוב להאכיל אותן נכון. GDNF נחוץ כדי לשמור על התאוששות רקמות והישרדות. חיתוך עם מסוק הוא טראומטי עבור הרקמה, ומסיבה זו, פרוסות ממוקמות זמן קצר לאחר החיתוך לתוך מדיום דיסקציה קר כקרח כדי לנקות את עודף של מולקולות פרו דלקתיות ומעודדות מוות. לאחר מכן, פרוסות מונחות על קרומי התרבית (תוספות תרבית תאים) עם מדיום טרי שונה עם GDNF כדי לקדם התאוששות מהירה יותר הידבקות פרוסה לממברנה. GDNF צריך להתווסף למדיום כל יום בשבוע הראשון בתרבות בגלל מחצית החיים הקצרה שלו50,51. ראינו כי פרוסות זקוקות לנוכחות רציפה של GDNF במהלך הימים הראשונים בתרבית כדי לקדם התאוששות רקמות וכדאיות. בכל מקרה, מכיוון שנוכחות GDNF חשובה לכל תקופת הטיפוח, מומלץ מאוד להפריע לניהול GDNF בנקודות זמן נוספות.
במהלך השבוע הראשון בתרבית, חשוב גם לבדוק את הפרוסות באופן מקרוסקופי בעין ובמיקרוסקופ. רקמה שקופה ושקיפות של הגבולות הם סימנים להידבקות נכונה של הפרוסות לממברנה ולרקמה בת קיימא. הרקמה הנמקית תיראה לבנה מאוד במבט מאקרוסקופי ראשון והאזורים הנמקיים ייראו אפורים כהים במיקרוסקופ. לאחר מספר שבועות בתרבית, המורפולוגיה של הרקמה עשויה להשתנות: תנועות התאים והיצמדות הרקמה לממברנה יכולות להשפיע על תהליך זה. ראינו, למשל, את אובדן הלומן המרכזי בכמה פרוסות מלאות תאים ואת אובדן המורפולוגיה של הקרן הגבית והגחון. זה קורה בעיקר עם פרוסות קטנות יותר, בעוד רובם ישמרו על מבנה אנטומי קרוב למקור. פרוסות נוצרות בדרך כלל מאזורי המותניים או החזה מכיוון שבדרך זו הם יכולים לקבל את הגודל המתאים כדי לשמור על ההיסטוארכיטקטורה המקורית שלהם לאורך זמן: אם הם קטנים מדי, הם מאבדים את הארכיטקטורה שלהם בעוד שאם גדולים מדי, האזור המרכזי יכול לעבור נמק. לכן, השתמשנו באזור המותני של גורי עכברים כדי ליצור פרוסות בגודל המתאים לגידול אופטימלי לטווח ארוך, אבל, באופן עקרוני, ניתן לשקול מקטעים אחרים. יתר על כן, בחרנו להשתמש באזור המותני, מכיוון שאזורי הגחון והגב נבדלים יותר זה מזה. בנוסף, אזור זה מציג אזורי רקמה עם אחוז גבוה יותר של נוירונים מוטוריים וחומר אפור, שהם אתרי עניין לטיפולים בתחליפי תאים ב- SCI. לגבי השתלת תאים בפרוסות, הבעיה העיקרית קשורה לשבירת קצה מיקרו-מחט הזכוכית. אם החור למעבר התאים גדול מדי, הוא עלול לגרום נזק לרקמת SC במהלך המיקרו-הזרקה. אם הוא קטן מדי, ערימת תאים יכולה לחסום את המחט, ולעכב את תהליך ההשתלה. הליך ההשתלה צריך להסתיים בתוך 1 שעה כדי למזער סבל תאים ומוות.
הפרוטוקול המוצע מספק כלי אופטימלי ורב-תכליתי לסוגים שונים של חקירות. כאן, אנו מיישמים את הפלטפורמה ארוכת הטווח שלנו כדי לאמת את ההשתלה של תאי h-SC-NES בשלבים הראשונים של התמיינות בתוך רקמת SC של עכבר למשך 30 יום. החידוש העיקרי של הגישה המוצעת הוא אופטימיזציה של פרוטוקול התרבות המשותפת. מרכיבי GM שומרים על הישרדות עצבית ארוכת טווח של פרוסות SC ותאי h-SC-NES המושתלים. ואכן, GM, בהיותו מדיום נטול סרום, מקיים את התמיינות התאים המושתלים לעבר הגורל העצבי ביחס למדיום ששימש בעבר לתרבית פרוסות אורגנוטיפית47.
לגבי המודלים המוצעים עבור SCI, ניסויים מבוצעים בדרך כלל על עכברים בוגרים. עד כה, ההבדלים החשובים ביותר בין SC יילודים ובוגרים קשורים לפוטנציאל ההתחדשות הגבוה יותר שנמצא בילוד ביחס לעכברים בוגרים52. עם זאת, להבדלים כאלה אין השפעה על סוג הפרוטוקול שאנו מציעים, שכן כאן אנו מתמקדים בתגובה של תאים מושתלים לסביבת הרקמה המארחת ולא ביכולות ההתחדשות של תאי העצב השוכנים. הבדל נוסף בין עכברים ילודים לעכברים בוגרים לאחר SCI קשור להיווצרות צלקת גליה המתרחשת אצל מבוגרים. היבט זה אינו נלקח בחשבון במודל המוצע, שאינו מתחשב בתהליכים הפיזיולוגיים המורכבים הנובעים מפגיעות ראשוניות ומשניות.
לגבי היישומים, הפלטפורמה יכולה לשמש גם כדי לחקור את האינטגרציה בין התאים המושתלים עם מעגלים תושבים הקיימים במודל האורגנוטיפי SC. כלי הנדסה גנטית כבר שימשו במערכת העצבים המרכזית להערכת קישוריות סינפטית וניתן היה לנצל אותם בהקשר זה 53,54,55. בפרט, ניתן לחקור ולאמת את האינטגרציה על ידי הערכת היווצרות הסינפסות בין התאים המושתלים לבין רקמת SC ex vivo. תרבויות אורגנוטיפיות ארוכות טווח אלה יכולות להיות מנוצלות גם לבדיקת חומרים נוירופרוטקטיביים ונוירורגנרטיביים או מולקולות/חומרים חדשים או לחקר הפרעות נוירודגנרטיביות המערבות את ה-SC. כדי לחקור הפרעות נוירודגנרטיביות ספציפיות, יש להתאים את הפרוטוקול לגידול פרוסות SC שנוצרו ממודלים רלוונטיים, כגון עכברים טרנסגניים הנושאים מוטציות ספציפיות הקשורות לפתולוגיה, בשלב הרלוונטי לפתולוגיה (כלומר, יילודים, נוער, מבוגרים). לסיכום, הפרוטוקול שלנו ותרביות אורגנוטיפיות בכלל, בהיותן צמחים של איבר מסוים, מציגות תכונות המגשרות על הפער בין תרביות תאים דו-ממדיות לבין מודלים in vivo, המאשרות אותם ככלי רב ערך הן למחקר בסיסי והן לבדיקות פרה-קליניות.

לפגיעה טראומטית בחוט השדרה (SCI) יש השלכות פיזיות, פסיכולוגיות וכלכליות הרסניות על מטופלים ומטפלים1. ניסיונות רבים נעשו לקדם התחדשות אקסונלית ב- SCI בגישות שונות 2,3,4 וכמה השפעות מועילות הודגמו על ידי היווצרות ממסרים עצביים בין נוירונים פרוקסימליים ודיסטליים באתר הפציעה באמצעות טיפולים בתחליפי תאים. העניין בטיפולים תאיים עדיין גדל5 מכיוון שתאים מושתלים יכולים למלא תפקידים רבים, כולל מתן תמיכה טרופית, אפנון חיסוני, חידוש מעגלים עצביים אבודים באמצעות השראת פלסטיות, החלפת תאים ורמיאלינציה של אקסונים6.
לאחרונה, המאמץ העיקרי בתחום התמקד בתאי גזע/אב עצביים אנושיים (NSCs/NPCs)7. מספר מחקרים מראים כי NSCs/NPCs מווסתים את תגובת האסטרוציטים8, מקדמים את הפרשת הגורמים הפרוגנרטיביים 9,10, ומחליפים תאים עצביים חסרים ב-SCI11,12. עם זאת, מחקרים התומכים בהתמיינות של תאים מושתלים לנוירונים פונקציונליים עדיין גרועים. יתר על כן, הישרדות התאים המושתלים וההתמיינות בחוט השדרה הפגוע (SC) הם נמוכים13, אולי משום שלתאים מושתלים לוקח מספר שבועות, אפילו חודשים, להתמיין in vivo. בנוסף, מחקרים עכשוויים לא הבהירו לחלוטין היבטים ביוכימיים, מולקולריים, תאיים ותפקודיים רבים של טיפולים בתחליפי תאים. בהקשר זה, נדרשים מודלים פשוטים, מהירים וחסכוניים כדי לחקור את מנגנוני קליטת התא, את יכולתם של תאים מושתלים להתרבות, להתמיין לסוגים או תת-אוכלוסיות ספציפיות של תאים, וליצור סינפסות עם תאי עצב שוכנים.
שילוב מחקרים היסטולוגיים ברישום אלקטרופיזיולוגי ובפרופיל שעתוק ופרוטאום הכרחי להבנה מלאה של המפל המולקולרי המתרחש לאחר השתלת תאים. זה בהחלט יאיץ את התכנון והאימות של טיפולים חדשים לתחליפי תאים במודלים פרה-קליניים ובמחקרים קליניים. ואכן, עד כה, השימוש במכרסמים, בעלי חיים גדולים ופרימטים לא אנושיים היה כדאי להבהרת תהליכים תאיים רבים לאחר השתלה14. עם זאת, בשל העלות הגבוהה, ההשפעה האתית הגבוהה, כמו גם את המורכבות של האורגניזם, השימוש בהם הוא לעתים קרובות לא פשוט או לא מספיק כדי לפענח תהליכים ביוכימיים ומולקולריים. בנוסף, הם עשויים להציג חסרונות רבים בקורלציה עם הבדלים ביולוגיים, הן בין מינים (מטבוליזם) ושונות תוך מינית (מין, גיל).  גורמים אלה, יחד עם גורמים חיצוניים כגון מצבים מלחיצים, יכולים לשנות את תוצאות הניסוי ואת יכולת החיזוי שלהם במונחים של תרגום טיפולי לבני אדם 15,16,17.
לפיכך, קבוצות רבות משתמשות בתרביות תאים דו-ממדיות במבחנה ובפרוסות אורגנוטיפיות ex vivo (תרביות ex vivo) בנוסף למודלים של בעלי חיים. תרבית תאים דו-ממדית היא המערכת הנפוצה ביותר לחקר תהליכים ביולוגיים ספציפיים ברמת תא בודד ו/או אוכלוסיית תאים. עם זאת, תרביות תאים חד-שכבתיות אינן משקפות את המורכבות המצויה באורגניזם שלם. היעדר מבני רקמה וסביבה פיזיולוגית אינו מאפשר למערכות התרבית הדו-ממדיות לחקות לחלוטין היבטים מבניים, מורפולוגיים ותפקודיים מרכזיים של הרקמה הנחקרת 18,19,20.תרבויות אורגנוטיפיות יכולות להתגבר על חלק מהבעיות הללו. מודלים אורגנוטיפיים מבוססים על שתילת שבר של רקמה או איבר ותחזוקתו ex vivo לתקופה מוגבלת21,22. בפרט, פרוסות של רקמה נטוע נוצרים עם עובי מדויק המאפשר חומרים מזינים להגיע בקלות כמעט לכל התאים בפרוסות. הם יכולים להיווצר מאזורים שונים של מערכת העצבים המרכזית, כגון ההיפוקמפוס, ההיפותלמוס, המוח הקטן, התלמוס, קליפת המוח, substantia nigra וסטריאטום, וחוט השדרה23. תרביות אורגנוטיפיות שומרות על ארכיטקטורת הרקמות, על ההתפלגות המרחבית של התאים, על המגוון התאי ועל הסביבה (כלומר, הרכב המטריצות החוץ-תאיות) של איבר המוצא. יתר על כן, הם משמרים את הפעילות העצבית המקורית, קשרים בין תאים, ובפרט, מעגלים למרחקים קצרים לאחר explant.
היבטים אלה מספקים כמה יתרונות לתרבויות ex vivo ביחס הן לתרבויות חד-שכבתיות והן למודלים של בעלי חיים. הם שומרים על תכונות רקמה מרכזיות שנמצאו in vivo אך עם הפחתת העלויות והאפשרות לבצע סוגים שונים של ניסויים מולקולריים, תאיים ופונקציונליים עם ויסות מדויק של הפרמטרים הסביבתיים של התרבית 24,25,26,27,28,29. פרוסות אורגנוטיפיות יכולות להיות מנוצלות גם לפיתוח מודלים להפרעות נוירולוגיות שונות על ידי הדמיית תכונות היסטופתולוגיות מרכזיות של מצבים ספציפיים30. יתר על כן, השמירה על סביבת הרקמה הרב-תאית המקורית הופכת אותם לפלטפורמות מתאימות לבדיקת תרופות ולבדיקת מולקולות וחומרים נוירו-פרוטקטיביים ונוירו-רגנרטיביים.
בעבודה זו אנו מציעים שימוש בתרביות אורגנוטיפיות SC כמודל לייעול השתלות מל"ל. זה לא טריוויאלי מכיוון שתנאי גידול אופטימליים נדרשים כדי להבטיח את הישרדותם של המאכסן (רקמת SC) וההשתלה (NSCs) במשך שבועות. קבוצות מחקר שונות המושתלות בתרביות אורגנוטיפיות, מוחיות ונגזרות SC, סוגים שונים של תאים. רוב העבודות הראו השתלה של תאי גזע מזנכימליים31,32,33, תאי מעטפת ריח34, או NSCs35,36,37,38,39,40 והעריכו את האינטראקציות של תאים מושתלים עם התאים המארחים, הישרדות המערכת כולה, והאם התאים המושתלים התמינו לנוירונים או לתאים דמויי נוירון בתוך סביבת הרקמה Ex Vivo 32,33,41. חלקם העריכו את פוטנציאל ההתחדשות של תאים לאחר ההשתלה, והתבוננו בגדילה האקסונלית שלהם בתוך הרקמה 37,40,41, ביכולת המיאלינציה של מבשרי אוליגודנדרוציטים מושתלים 42, בנדידת התאים המושתלים לרקמה המארחת43, והאם התאים המושתלים שחררו גורמים שדחפו לסביבה מתחדשת31. מגבלה אחת של המחקרים הנוכחיים היא שהם אינם חוקרים את ההשתלה במשך תקופה ארוכת טווח.
בהתחשב בכך שנראה כי NSCs דורשים מספר שבועות כדי להבדיל in vivo 44,45, מחקר זה מתמקד כיצד ליצור ולתחזק פרוסות SC עכבר לטווח ארוך (≥30 ימים) למשך עד 90 יום. נמצא כי פרוסות שומרות על המבנה האנטומי המקורי שלהן ושומרות על קצב אפופטוטי נמוך ויציב לאורך זמן ועל כדאיות גבוהה של תאים. נצפו ביטוי מפוזר של סמנים עצביים RNA קושר שועל-1 הומולוג 3 (RBFOX3) ושרשרת אור נוירופילמנט (NFL), כאשר האחרונים הראו מגמה הולכת וגוברת של נביטה אקסונלית סביב הפרוסות לאורך זמן, המעידה על מצבן הבריא. יתר על כן, השתלנו בהצלחה בתאי גזע נוירואפיתל אנושיים המבטאים GFP (h-SC-NES) בשלבים הראשונים של התמיינות עצבית. השתל נשמר במשך 30 יום לאחר ההשתלה והתאים הראו ביטוי GFP במשך כל התקופה בתרבית. שיעור אפופטוטי של תאים ביום שלאחר ההשתלה (DPT) 30 נמצא גם הוא בקנה אחד ביחס לערך קצב אפופטוטי שנצפה ב- DPT 7 באותם תאים40. נראה כי התאים השתלבו בסביבת הרקמה ושרדו עד מספר שבועות.
לסיכום, הנתונים שלנו מראים כי ניתן לשמור בתרבית פרוסות אורגנוטיפיות SC במשך 3 חודשים מבלי לפגוע בציטוארכיטקטורה המקורית שלהן ובסביבת הרקמות. והכי חשוב, ניתן לנצל אותם כדי לבחון טיפולים תאיים לפני שממשיכים בניסוי in vivo , ובכך להפחית את העלויות ואת זמן הניסוי. כאן, אנו ממחישים בפירוט את כל הקטעים ליצירת פרוסות אורגנוטיפיות של עכבר SC וכיצד לשמור עליהם לתקופות ארוכות טווח (≥30 יום). יתר על כן, אנו מסבירים לעומק כיצד לבצע השתלת NPC לתוך הפרוסות וכיצד לשמור אותם לניתוח במורד הזרם.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-cleaved Caspase-3,&#160; (Asp175) (5A1E) (Rabbit)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9661S</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP (Mouse) - monoclonal</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>G6539</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Human Nuclei (Mouse) - monoclonal, clone 235-1&#160;</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>MAB1281</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Human Nuclei (Rabbit)</td>
			<td>NeoBiotechnologies</td>
			<td>RBM5-346-P1</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NeuN (RBFOX3) (Rabbit) - polyclonal</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>ABN78</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NFL (Mouse)</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>MAB1615</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NFL H-Phospho (Rabbit) -polyclonal</td>
			<td>Biologend</td>
			<td>840801</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Polymount</td>
			<td>Poly-sciences</td>
			<td>18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC7074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>118364227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture graded water</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>W3500-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from rat tail</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>C7661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope - A1 Confocal Microscope (Eclipse Ti)</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>gf144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-2</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>03-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>SRP3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries, 3.5&#34;&#160;</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti Mouse IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti Mouse IgG Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21236</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti Rabbit IgG Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11011</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti Rabbit IgG Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21244</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph Pad-Prism</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td></td>
			<td>Software for Statistical Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-050</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral prep</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>17446-LV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L32250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11090-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>to load cells in the needle for transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell cell culture membrane</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscroscope cover glasses</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>ECN 631-1572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (35mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pasteur pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1171.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV830</td>
			<td>Microinjector for transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>SWAN3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle #3</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope for imaging and acquisition</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope for surgery</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers-Dumont #5-inox</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Scissors, 8.5 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical micropipette puller</td>
			<td>Shutter Instrument</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254/50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term mouse spinal cord organotypic slice culture as a platform for validating cell transplantation in spinal cord injury

תרופות נחושות לפגיעות בעמוד השדרה (SCIs) עדיין חסרות, בשל הפתופיזיולוגיה המורכבת. אחת הגישות הרגנרטיביות המבטיחות ביותר מבוססת על השתלת תאי גזע כדי להחליף רקמות שאבדו ולקדם התאוששות תפקודית. יש להמשיך ולחקור גישה זו טוב יותר במבחנה ובאקס ויו לבטיחות ויעילות לפני שנמשיך בניסויים יקרים יותר וגוזלים זמן רב יותר בבעלי חיים. בעבודה זו, אנו מראים את הקמתה של פלטפורמה ארוכת טווח המבוססת על פרוסות אורגנוטיפיות של חוט השדרה של עכבר (SC) שהושתלו בתאי גזע עצביים אנושיים כדי לבחון טיפולים תחליפיים תאיים עבור SCIs.
תרביות אורגנוטיפיות סטנדרטיות של SC נשמרות במשך כשבועיים או שלושה במבחנה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול ממוטב לתחזוקה לטווח ארוך (≥30 יום) למשך עד 90 יום. המדיום המשמש לגידול ארוך טווח של פרוסות SC הותאם גם להשתלת תאי גזע עצביים במודל האורגנוטיפי. תאי גזע נוירואפיתל אנושיים שמקורם ב-SC (H-SC-NES) הנושאים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) הושתלו בפרוסות SC של עכבר. שלושים יום לאחר ההשתלה, התאים עדיין מראים ביטוי GFP וקצב אפופטוטי נמוך, דבר המצביע על כך שהסביבה האופטימלית שמרה על הישרדותם והשתלבותם בתוך הרקמה. פרוטוקול זה מייצג התייחסות חזקה לבדיקה יעילה של טיפולים בתחליפי תאים ברקמת SC. פלטפורמה זו תאפשר לחוקרים לבצע סינון מקדים ex vivo של טיפולים שונים להשתלת תאים, ותסייע להם לבחור את האסטרטגיה המתאימה ביותר לפני שהם ממשיכים בניסויי in vivo .

Traumatic spinal cord injury (SCI) has devastating physical, psychological, and economic consequences for patients and caregivers1. Many attempts have been made to promote axonal regeneration in SCI with different approaches2,3,4 and some beneficial effects were demonstrated by the formation of neuronal relays between proximal and distal neurons in the injury site through cell replacement therapies. The interest in cell therapies is still growing5 since transplanted cells can play many roles, including providing trophic support, immune modulation, regenerating lost neural circuits through induction of plasticity, cell replacement, and axon remyelination6.
Recently, the main effort in the field focused on human neural stem/progenitor cells (NSCs/NPCs)7. Several studies suggest that NSCs/NPCs modulate astrocyte response8, promote the secretion of proregenerative factors9,10, and replace missing neuronal cells in SCI11,12. However, studies that support the differentiation of transplanted cells into functional neurons are still poor. Moreover, transplanted cell survival and differentiation in the injured spinal cord (SC) are low13, possibly because transplanted cells take several weeks, even months, to differentiate in vivo. Additionally, current studies have not completely elucidated many biochemical, molecular, cellular, and functional aspects of cell replacement therapies. In this context, simple, fast, and cost-effective models are required to study the mechanisms of cell engraftment, the ability of engrafted cells to proliferate, differentiate into specific types or subpopulations of cells, and form synapses with resident neurons.
Integrating histological studies into electrophysiological recording and transcriptome and proteome profiling is necessary for a full comprehension of the molecular cascade occurring after cell transplantation. This certainly will speed up the design and validation of new cell replacement therapies in preclinical models and clinical studies. Indeed, to date, the use of rodents, large animals, and non-human primates has been worthwhile for elucidating many cellular processes after transplantation14. However, due to the high cost, the high ethical impact, as well as the complexity of the organism, their use is often not straightforward or not adequate to unravel biochemical and molecular processes. In addition, they may present many disadvantages correlated with biological differences, both interspecies (metabolism) and intraspecies variability (sex, age).&#160;&#160;These factors, together with external factors such as stressful situations, could alter the outcome of an experiment and their predictability in terms of therapeutic translation to humans15,16,17.
Thus, many groups employ 2D in vitro cell culture and ex vivo organotypic slices (ex vivo cultures) in addition to animal models. 2D cell culture is the most commonly used system for studying specific biological processes at a single-cell and/or cell population level. Nevertheless, monolayer cell cultures do not reflect the complexity found in a whole organism. The lack of tissue structures and&#160;physiological environment does not allow the 2D culture systems to completely emulate key structural, morphological, and functional aspects of the investigated tissue18,19,20. Organotypic cultures can overcome some of these issues. Organotypic models are based on explanting a fragment of a tissue or organ and maintaining it ex vivo for a limited period21,22. In particular, slices of the explanted tissue are generated with a precise thickness that allows nutrients to easily reach almost all the cells in the slices. They&#160;can be generated from various regions of the central nervous system, such as the hippocampus, hypothalamus, cerebellum, thalamus, cerebral cortex, substantia nigra and striatum, and spinal cord23. Organotypic cultures retain the tissue architecture, the spatial distribution of cells, the cellular diversity, and the environment (i.e., extracellular matrix composition) of the organ of origin. Moreover, they preserve the original neural activity, connections between cells, and in particular, short-distance circuits after the explant.
These aspects provide some advantages for ex vivo cultures with respect to both monolayer cultures and animal models. They retain key tissue features found in vivo but with the reduction of the costs and the possibility to perform different types of molecular, cellular, and functional experiments with an accurate regulation of the culture environmental parameters24,25,26,27,28,29. Organotypic slices can also be exploited to develop models for different neurological disorders by resembling key histopathological features of specific conditions30. Moreover, the retention of the original multicellular tissue environment renders them appropriate platforms for drug screening and for testing neuroprotective and neuro-regenerative molecules and materials.
In this work, we propose the use of SC organotypic cultures as a model to optimize NSC transplants. This is not trivial since optimal culturing conditions are required to guarantee the survival of both the host (SC tissue) and the transplant (NSCs) for weeks. Different research groups engrafted in organotypic cultures, brain-derived and SC-derived, various types of cells. Most of the works showed the transplantation of mesenchymal stem cells31,32,33, olfactory ensheathing cells34, or NSCs35,36,37,38,39,40 and evaluated the interactions of engrafted cells with the host cells, the survival of the whole system, and whether the transplanted cells differentiated into neurons or neuron-like cells inside the ex vivo tissue environment32,33,41. Some of them evaluated the regenerative potential of cells after transplant, observing their axonal growth inside the tissue37,40,41, the myelinating ability of engrafted precursors of oligodendrocytes42, the migration of engrafted cells into the host tissue43, and whether the transplanted cells released factors pushing towards a proregenerative environment31. One limitation of the current studies is that they do not explore the engraftment for a long-term period.
Considering that NSCs seem to require several weeks to differentiate in vivo44,45, this study focuses on how to generate and maintain long-term (&#8805;30 days) mouse SC slices for up to 90 days. Slices were found to retain their original anatomical structure and to maintain a low and stable apoptotic rate over time and high cell viability. We observed diffuse expression of neuronal markers RNA binding fox-1 homolog 3 (RBFOX3) and neurofilament light chain (NFL), with the latter showing an increasing trend of axonal sprouting around the slices over time, attesting to their healthy condition. Moreover, we successfully transplanted into the SC-slices GFP-expressing human SC-derived neuroepithelial stem (h-SC-NES) cells at the first stages of neuronal differentiation. The NSC graft was maintained for 30 days after transplant and cells showed GFP expression for all the period in culture. The apoptotic rate of cells at day post-transplant (DPT) 30 was also found to be in line with respect to the apoptotic rate value observed at DPT 7 in the same cells40. Cells seemed to engraft into the tissue environment and survived up to several weeks.
In summary, our data demonstrate that it is possible to maintain in culture SC organotypic slices for 3 months without compromising their original cytoarchitecture and the tissue environment. Most importantly, they can be exploited to test cell therapies before proceeding with an in vivo experiment, thus reducing the costs and the experimental time. Here, we illustrate in detail all the passages to generate mouse SC organotypic slices and how to maintain them for long-term periods (&#8805;30 days). Moreover, we deeply explain how to perform NPC transplantation into the slices and how to maintain them for downstream analysis.

מחבר זרקור: תרבית ארוכת טווח של פרוסות חוט השדרה לקידום טיפולים להתחדשות חוט השדרה

תרבית פרוסה אורגנוטיפית של חוט השדרה של עכבר לטווח ארוך כפלטפורמה לאימות השתלת תאים בפגיעה בחוט השדרה

We are interested in developing a promising regenerative approach to address spinal cord injuries. In this paper, we validate spinal cord organotypic model for testing cellular replacement therapies in spinal cord research. So far, spinal cord organotypic models are maintained in culture for two or three weeks in vitro.And subculture media are suboptimal for neural stem cell engraftment, differentiation, and maturation. Cell replacement therapies still require the improvement to announce the ability of the grafted cells to reconstitute the lost circuits. Through this protocol, we provide a novel, long-term ex vivo platform to tackle cell transplant related issue like survival, integration, and maturation rate of the engrafted neural stem cells.This platform will be helpful for researchers to find the best strategy for cell transplantation, reducing the number of animals required for in vivo validation. Our protocol is simple, fast, and cost-effective to perform proof of concept and optimization studies.

השיטות המתוארות מאפשרות הקמת פרוסות אורגנוטיפיות SC מעכברים בשלב P3 ותחזוקתן בתרבית למשך זמן ממושך בתנאים בריאים. יתר על כן, אנו מראים פרוטוקול להשתלת תאים בפרוסות ולגידול משותף שלהן למשך עד 30 יום (איור 1). ראשית, אנו מראים אופטימיזציה של תנאי התרבית ופרוטוקול המתאים לגידול ממושך של פרוסות SC עם תאים מושתלים (איור 2A). פרוסות נוצרות ומתוחזקות מ-DEV 0 עד DEV 2 ב-OM, שהוצע במקור כמדיום אופטימלי לתחזוקת פרוסות SC47. עם זאת, בשל נוכחותם של חלבונים בסרום, מדיום זה יכול להיות suboptimal כדי לקיים את ההתמיינות העצבית ואת ההתבגרות של תאים מבשר עצבי מושתל. ואכן, ב-DEV 3 בדקנו את המעבר מ-OM ל-GM, פורמולציה המכילה Neurobasal בתוספת B27, התומכת בהישרדות עצבית, וללא סרום, המעכב את ההתמיינות העצבית הנכונה, ומקדם במקום זאת גורל גלייה 48,49.
איור 2B מראה את התוצאות שהושגו על-ידי החלפת המדיום ב-DEV 3 מ-OM ל-GM, בהשוואה לפרוסות SC שלא קיבלו את המתג (פרוסות הבקרה גודלו בתרבית ב-OM). השתמשנו בפיזור אות ה-NFL בתוך הפרוסות כסמן לשלמות עצבית (איור 2B,C). פרוסות ב-DEV 7 היו בריאות בשני תנאי הגידול, והראו את ההתפלגות המפוזרת של נוירופילמנט (NFL, בירוק) בתוכם. ב-DEV 10, פרוסות שתורבתו ב-GM נראו בריאות יותר ביחס לפרוסות הבקרה שתורבתו ב-OM, כפי שתועד על ידי הפצת כתמים ב-NFL. הערכנו גם את שטח NFL+ (% NFL+ Area/DAPI+ Area) של הפרוסות שמוצגות בתמונות המייצגות של איור 2B. אזור ה-NFL+ המשוער מיוצג בהיסטוגרמות באיור 2C, מה שמאשר שאות ה-NFL מפוזר באופן מפוזר בפרוסות ב-DEV 7 בשני התנאים. עם זאת, ב-DEV 10, השטח המשוער המכוסה על ידי צביעת NFL פוחת עבור מצב התרבות OM.
נתונים אלה מצביעים על כך שהמעבר ל-GM ב-DEV 3 נסבל היטב לגידול ממושך של פרוסות SC (DEV 10). בשלב הבא, בדקנו את GM בנקודות זמן ממושכות יותר: DEV 30, DEV 60 ו-DEV 90. כפי שניתן לראות באיור 3A,B, פרוסות נשמרו בריאות בתרבית עד DEV 90. צביעת NFL נמצאה באופן נרחב בפרוסות בכל נקודת זמן, עם נביטה מפוזרת סביב פרוסות הנוירוטים היוצאות מאזור המרכז. ואכן, הערכנו את שטח ה-NFL+ של הפרוסות שמוצגות באיור 3A, והוא גדל עם הזמן כפי שמוצג בהיסטוגרמות של איור 3B. ראינו גם חיוביות לסמן העצבי RBFOX3, מה שסיפק קו נוסף של ראיות להתמיינות העצבית של הפרוסות. בכל נקודת זמן, בדקנו גם את קצב האפופטוזיס על-ידי הערכה בפרוסות שונות של מספר התאים החיוביים ל-aCASP3 (איור 4A,B). הניתוח בוצע כמתואר בסעיף 10.2 לפרוטוקול. שיעור אפופטוטי (% תאי aCASP3+ / המספר הכולל של תאי DAPI+) נמצא נמוך מאוד בכל נקודת זמן (0.85 ± 0.52%, 0.71 ± 0.27%, 0.66 ± 0.45% עבור DEV 30, 60 ו- 90, בהתאמה) ללא הבדלים משמעותיים בין שלוש נקודות הזמן הנחשבות (ערך p > 0.05, איור 4B). נתונים אלה מצביעים על כך שהקצב האפופטוטי הקשור ל-aCASP3 נשאר יציב לאורך זמן, ויחד עם הפיזור הרחב של NFL בפרוסות (איור 4A), מאשרים את הישרדות הפרוסות בכל נקודת זמן.
כתמיכה לנתונים קודמים, ביצענו גם בדיקה חיה/מתה כדי להעריך את הכדאיות של הפרוסות בשלוש נקודות הזמן השונות. השתמשנו בקלצין (צביעה ירוקה) כדי לתייג את התאים הפעילים מבחינה מטבולית ובסיטוקס (צביעת ציאן) כדי להעריך מוות תאי. כפי שניתן לראות בהיסטוגרמות באיור 4C, אחוז התאים הפעילים מטבולית עולה מעט מ-DEV 30 ל-DEV 90 (93.17 ±-5.21%, 96.43 ±-3.02%, 96.33 ±-3.10% עבור DEV 30, 60 ו-90, בהתאמה), ומתייצב בין שתי נקודות הזמן האחרונות (DEV 30 לעומת DEV 60 p-value = 0.018; DEV 30 לעומת DEV 90 p-value = 0.027; DEV 60 לעומת DEV 90 p-value = 0.99). מצאנו רמות נמוכות של מוות תאי שירדו עם הזמן (6.83 ±-5.21%, 3.57 ±-3.02%, 3.66 ±-3.10% עבור DEV 30, 60 ו-90, בהתאמה) ונמצא הבדל משמעותי בין DEV 30 לבין נקודות זמן מאוחרות יותר, DEV 60 ו-DEV 90 (DEV 30 לעומת DEV 60 p-value = 0.018; DEV 30 לעומת DEV 90 p-value = 0.027; DEV 60 לעומת DEV 90 p-value = 0.99). נתונים אלה, בשילוב עם שיעור האפופטוזיס, מאשרים את הישרדות הפרוסה לאורך זמן ותומכים ביעילות פרוטוקול הטיפוח ארוך הטווח המבוצע.
לאחר שנקבעה ההיתכנות של תרבית ממושכת של פרוסות SC, אתגרנו את המערכת על ידי השתלת תאי h-SC-NES בשלבים הראשונים של התמיינות עצבית. בדקנו את תאי h-SC-NES מכיוון שהם הראו תוצאות מבטיחות לטיפול ב-SCI12. הליך ההשתלה של תאי h-SC-NES בפרוסות SC של העכבר מתואר בסעיף 6 של הפרוטוקול. פרוסות SC ותאי h-SC-NES שהושתלו נשמרו עד DPT 30. תאים הושתלו ב-DIV 10 של התמיינות (שלב מקדים עצבי) לפרוסות אורגנוטיפיות של DEV 4, כפי שמוצג בסכמת הפרוטוקולים של איור 5A. התאים המושתלים נוטרו לביטוי GFP בתרבית במשך עד 30 יום. איור 5B מציג תמונות חיות מייצגות, ב-DPT שונה, של פרוסת SC עם תאי GFP+ מושתלים. הביטוי היציב של GFP לאורך זמן (איור 5B ואיור 6A) מצביע על כך שתאים שרדו לתוך רקמת SC בתנאי התרבית שעברו אופטימיזציה בעבר. בדקנו גם את שיעור האפופטוטי של תאים מושתלים כמתואר בסעיף 10.2 לפרוטוקול. שיעור האפופטוטי (% aCASP3+ תאים/המספר הכולל של תאי Hu-Nu+ ) נמצא נמוך מאוד (0.44 ± 0.34%) לאחר 30 DPT (איור 6B). יתר על כן, שיעור אפופטוטי ב DPT 30 נמצא בקנה אחד עם זה שנמצא עבור אותו סוג של תאים ב DPT 7, כפי שדווח בעבר40, תיעוד כי התרביות מתייצבים לאורך זמן.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig01.jpg"> איור 1: זרימת העבודה של הפרוטוקול. סכימה מייצגת המציגה את זרימת העבודה הכללית של הפרוטוקול שבוצע. (A) משמאל, סכימה המסכמת יצירת פרוסות SC-פרוסות עכבר מ-SC מבודד של גורי עכברים ב-P3 וטיפוח ארוך טווח של פרוסות אורגנוטיפיות SC. (B) מימין, סכימה המסכמת השתלה של תאי h-SC-NES המבטאים GFP בפרוסות SC-organotypic של עכבר. תאים מושתלים נשמרים במשך 30 יום לאחר ההשתלה. קיצורים: h-SC-NES = גזע נוירואפיתל הנגזר מחוט השדרה האנושי; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; DEV = יום ex vivo; DPT = יום לאחר ההשתלה; NFL = שרשרת אור נוירופילמנט; RBFOX3= RNA קושר פוקס-1 הומולוג 3; aCASP3 = קספאז-3 פעיל; SC= חוט השדרה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig02v2.jpg"> איור 2: אופטימיזציה של תנאי גידול ארוכי טווח. (A) תוכנית מייצגת של הפרוטוקול לבדיקת OM ו- GM. OM נשמר עד DEV 7-10 עבור קבוצת הביקורת. המדיום עובר ל-GM ב-DEV 3 עבור הפרוסות המטופלות; לאחר מכן, הם קבועים ב- DEV 7-10 להשוואה לבקרות. (B) תמונות מייצגות המשוות פרוסות אורגנוטיפיות של עכבר SC ב-DEV 7 ו-10 בתרבית בתנאים שונים. פרוסות מוכתמות עבור הסמן cytoskeletal סמן neurofilament (NFL, ירוק). התפוצה הרחבה של כתמי NFL בפרוסות שתורבתו עם GM מצביעה על הישרדות כללית ובידול. גרעינים מוכתמים ב-DAPI. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (C) היסטוגרמות מייצגות של אומדן השטח המכוסה על-ידי NFL בפרוסות המוצגות באיור 1B. ב-DEV 10, שטח הפנים של ה-NFL יורד בתנאי התרבות של OM. קיצורים: DEV = day ex vivo; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; NFL = שרשרת אור neurofilament.; OM = מדיום אורגנוטיפי; GM = מדיום השתל; SC = חוט השדרה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig03v3.jpg"> איור 3: פרוסות אורגנוטיפיות של עכבר מתורבת לטווח ארוך. (A) פרוסות נשמרות בתרבית עד DEV 90. בדיקת אימונופלואורסנציה מגלה תפוצה רחבה של הסמן הציטו-שלד נוירופילמנט (NFL, ירוק) והסמן העצבי הגרעיני RBFOX3 (אדום), המעידים על מצבם הבריא וזהותם העצבית לאחר תרבית ארוכת טווח. יש לציין כי אקסונים מסוג NFL+ נובטים החוצה באופן מפוזר סביב הפרוסות לאורך זמן. גרעינים מוכתמים ב-DAPI. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (B) היסטוגרמות מייצגות של אומדן השטח והזמן של NFL+ ושטח RBFOX3+ של הפרוסות המוצגות בלוח A. שטח הנוירוט NFL+ גדל עם הזמן. קיצורים: DEV = day ex vivo; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; NFL = שרשרת אור נוירופילמנט; SC = חוט השדרה; RBFOX3= RNA קושר פוקס-1 הומולוג 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig04.jpg"> איור 4: הערכת כדאיות התא בפרוסות SC לאורך זמן. (A) תמונות מייצגות של פרוסות אורגנוטיפיות ב-DEV 60 מוכתמות עבור aCASP3 (אדום) ו-NFL (ירוק). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. NFL מראה תבנית מפוזרת. תאים נדירים חיוביים לסמן אפופטוטי aCASP3 (כניסה: 1-2-3). (B) ניתוח קצב האפופטוזיס בפרוסות בנקודות זמן שונות. ממוצע ± SD, N (משוכפל) = 6 פרוסות, n (סה"כ תאים) > 1,000 עבור כל פרוסה, מבחן Kruskal-Wallis, השוואה מרובה, ערך p > 0.05. קצב האפופטוטי יציב לאורך זמן. בכניסות 1-2-3 של לוח A, ניתן לצפות בפרטים של תאים חיוביים עבור aCASP3 (צביעה אדומה, חצים לבנים). נקודות אדומות קטנות מסמנות פסולת תאים וגרעינים פיקנוטיים. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (C) תמונות מייצגות של בדיקה חיה/מתה המבוצעת על פרוסות SC ב-DEV 90: תאים פעילים מטבולית מסומנים בירוק עם Calcein, בעוד תאים מתים ופגועים מסומנים בכחול בהיר (ציאן) עם Sytox. שתי ההיסטוגרמות מראות את % התאים החיוביים עבור קלצאין (משמאל) וסיטוקס (מימין) במספר התאים הכולל. עבור שניהם ממוצע ± SD, N (משוכפל) = 6 פרוסות, n (סה"כ תאים) > 1,000 עבור כל פרוסה, מבחן Kruskal-Wallis, השוואה מרובה, DEV 30 לעומת DEV 60 p-value = 0.018; DEV 30 לעומת DEV 90 p-value = 0.027; DEV 60 לעומת DEV 90 ערך p > 0.99. קיצורים: DEV = day ex vivo; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; NFL = שרשרת אור נוירופילמנט; SC = חוט השדרה; aCASP3 = קספאז-3 פעיל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig05.jpg"> איור 5: השתלת תאי h-SC-NES בפרוסות אורגנוטיפיות של עכבר. (A) תכנית מייצגת של פרוטוקול ההשתלה. תאים מושתלים כמבשרים עצביים ב-DIV 10 של התמיינות לפרוסות אורגנוטיפיות של DEV 4. (B) תמונות מייצגות של פרוסות אורגנוטיפיות של עכברים שהושתלו בתאי h-SC-NES המבטאים GFP לאורך זמן עד DPT 30. תאים מומרים עם וקטור lentiviral הנושא את הגן GFP . ביטוי GFP לאורך זמן מאשר את הכדאיות וההתאמה שלהם לסביבת הפרוסה. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. קיצורים: DIV = היום הראשון לפני ההבחנה; h-SC-NES = גזע נוירואפיתל הנגזר מחוט השדרה האנושי; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; DEV = יום ex vivo; OM = מדיום אורגנוטיפי; GM = מדיום השתל; DPT = ימים לאחר ההשתלה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig06.jpg"> איור 6: הערכת שיעור אפופטוזיס של תאי h-SC-NES מושתלים לאחר 30 יום מההשתלה. (A) תמונה מייצגת של פרוסה אורגנוטיפית של עכבר שהושתלה בה תאי h-SC-NES המבטאים GFP. התאים מומרים עם וקטור לנטיויראלי הנושא את הגן GFP לניטור שלהם לתוך הפרוסות לאחר ההשתלה. ביטוי GFP לאורך זמן מאשר את הכדאיות וההתאמה שלהם לסביבת הפרוסה. נקודת הזמן המוצגת היא DPT 30; תאים מוכתמים עבור גרעינים אנושיים (ציאן) ו aCASP3 (אדום). סרגל קנה מידה = 150 מיקרומטר. (B) משמאל, תרשים עוגה מייצג של ניתוח אפופטוזיס של תאים שהושתלו בפרוסות ב- DPT 30 (N (משוכפל) = 5 פרוסות, n (תאים) = 5,000), ומימין, כניסה של תאי Hu-Nu+ ופרט של תא חיובי ל- aCASP3 (חץ לבן). סרגל קנה מידה = 75 מיקרומטר. נקודות אדומות קטנות מסמנות פסולת תאים וגרעינים פיקנוטיים. קיצורים: h-SC-NES = גזע נוירואפיתל הנגזר מחוט השדרה האנושי; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; DPT = יום לאחר ההשתלה; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; NFL = שרשרת אור נוירופילמנט; aCASP3 = קספאז-3 פעיל; Hu-Nu = גרעינים אנושיים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה 1: הרכב הפתרונות המשמשים בפרוטוקול זה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704_Tables%20of%20Solutions%20rev.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Long-Term Spinal Cord Slice Culture for Advancing Spinal Cord Regeneration Therapies at JoVE.com

במאמר זה, אנו מספקים שיטה ניתנת לשחזור ליצירה ותחזוקה של פרוסות אורגנוטיפיות ארוכות טווח של חוט השדרה שהושתלו בתאי גזע עצביים כמודל ex vivo לבדיקת טיפולים תחליפיים תאיים.

Resolutive cures for spinal cord injuries (SCIs) are still lacking, due to the complex pathophysiology. One of the most promising regenerative approaches ...

אנו מעוניינים לפתח גישה רגנרטיבית מבטיחה לטיפול בפגיעות בעמוד השדרה. במאמר זה, אנו מאמתים את המודל האורגנוטיפי של חוט השדרה לבדיקת טיפולים תחליפיים תאיים במחקר חוט השדרה. עד כה, מודלים אורגנוטיפיים של חוט השדרה נשמרים בתרבית במשך שבועיים או שלושה במבחנה.ומדיה תת-תרבותית אינה אופטימלית לקליטה, התמיינות והתבגרות של תאי גזע עצביים. טיפולים בתחליפי תאים עדיין דורשים את השיפור כדי להכריז על יכולתם של התאים המושתלים לשחזר את המעגלים שאבדו. באמצעות פרוטוקול זה, אנו מספקים פלטפורמת ex vivo חדשנית וארוכת טווח להתמודדות עם בעיות הקשורות להשתלת תאים כמו הישרדות, אינטגרציה וקצב ההבשלה של תאי גזע עצביים מושתלים.פלטפורמה זו תסייע לחוקרים למצוא את האסטרטגיה הטובה ביותר להשתלת תאים, ותפחית את מספר בעלי החיים הדרושים לאימות in vivo. הפרוטוקול שלנו פשוט, מהיר וחסכוני לביצוע מחקרי הוכחת היתכנות ואופטימיזציה.

long-term-mouse-spinal-cord-organotypic-slice-culture-as-platform-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Long-Term Mouse Spinal Cord Organotypic Slice Culture as a Platform for Validating Cell Transplantation in Spinal Cord Injury

709 Views.  University of Pisa. אנו מעוניינים לפתח גישה רגנרטיבית מבטיחה לטיפול בפגיעות בעמוד השדרה. במאמר זה, אנו מאמתים את המודל האורגנוטיפי של חוט השדרה לבדיקת טיפולים תחליפיים תאיים במחקר חוט השדרה. עד כה, מודלים אורגנוטיפיים של חוט השדרה נשמרים בתרבית במשך שבועיים או שלושה במבחנה.ומדיה תת-תרבות?...

Video: מחבר זרקור: תרבית ארוכת טווח של פרוסות חוט השדרה לקידום טיפולים להתחדשות חוט השדרה

Resolutive cures for spinal cord injuries (SCIs) are still lacking, due to the complex pathophysiology. One of the most promising regenerative approaches is based on stem cell transplantation to replace lost tissue and promote functional recovery. This approach should be further explored better in vitro and ex vivo for safety and efficacy before proceeding with more expensive and time-consuming animal testing. In this work, we show the establishment of a long-term platform based on mouse spinal cord (SC) organotypic slices transplanted with human neural stem cells to test cellular replacement therapies for SCIs.
Standard SC organotypic cultures are maintained for around 2 or 3 weeks in vitro. Here, we describe an optimized protocol for long-term maintenance (&#8805;30 days) for up to 90 days. The medium used for long-term culturing of SC slices was also optimized for transplanting neural stem cells into the organotypic model. Human SC-derived neuroepithelial stem (h-SC-NES) cells carrying a green fluorescent protein (GFP) reporter were transplanted into mouse SC slices. Thirty days after the transplant, cells still show GFP expression and a low apoptotic rate, suggesting that the optimized environment sustained their survival and integration inside the tissue. This protocol represents a robust reference for efficiently testing cell replacement therapies in the SC tissue. This platform will allow researchers to perform an ex vivo pre-screening of different cell transplantation therapies, helping them to choose the most appropriate strategy before proceeding with in vivo experiments.

In this paper, we provide a reproducible method to generate and maintain long-term spinal cord organotypic slices transplanted with neural stem cells as an ex vivo model for testing cellular replacement therapies.