传统的扩散培养方法往往无法概括活器官的复杂环境，导致组织特异性标志物和功能的丧失。我们开发了一种开顶芯片，结合了扩散培养和微流体原理，以密切模拟上皮组织的微环境。通过包括天然存在于活体器官中但经常被传统体外模型忽视的生化和生物力学线索，开顶芯片代表了封闭系统之间的更好选择。
今天演示该程序的是Adya Panchal，我实验室的一名研究生。首先，将所需的试剂放在冰上的生物安全柜下。培养组织特异性间充质细胞以获得80%至90%的汇合度，然后根据制造商的建议使用胰蛋白酶或其他方法解离细胞。
在24摄氏度下以250克沉淀细胞5分钟。将细胞沉淀重悬于冰冷的10X EMEM和重建缓冲液的225微升中。通过移液混合细胞并加入1， 800微升冰冷的胶原蛋白1溶液。
接下来，通过上下移液五到六次在冰上混合预凝胶溶液。用18微升一种普通氢氧化钠中和预凝胶溶液，通过移液轻轻混合，然后将150微升含有细胞的水凝胶移液到开顶芯片的中央室中，同时避免气泡。将芯片分组到单独的培养皿中，包括在每个培养皿中装有两毫升无菌双蒸水的离心管盖，并将培养皿在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育。
为了进行基质水凝胶的表面微图案化，将20微升中和的胶原蛋白1预凝胶溶液移液在无菌3D打印印章的图案表面上，并将印章插入开顶腔室内，而基质水凝胶仍为液体形式。使用吸气器清除可能从开顶腔室顶部溢出的任何水凝胶残留物。如前所述，将所有芯片分组到带有装满水的锥形管盖的单独培养皿中。
并将所有培养皿在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 90 分钟。在孵育结束时，将芯片带回生物安全柜下，并使用精密镊子轻轻取出印章，以降低损坏水凝胶的风险。一旦培养的细胞达到80%至90%的汇合度，按照细胞提供者的建议，使用蛋白水解酶程序解离细胞。
解离后，通过离心沉淀细胞并将上皮细胞重悬至手稿中所述的适当细胞片段密度。为了接种上皮细胞，将芯片从培养箱转移到生物安全柜中，并用100微升新鲜上皮细胞培养基冲洗基质表面三次，以去除任何多余的涂层溶液。吸出冲洗介质后，使用适当的细胞密度用50微升上皮细胞悬液接种水凝胶表面，然后将芯片转移回培养箱中两个小时。
为了去除细胞碎片，用细胞培养基轻轻冲洗水凝胶表面两次，通过在密封的可高压灭菌容器中高压灭菌来刷新培养基，并将芯片连接到蠕动泵。暂停蠕动泵，小心地断开切屑与泵的连接，然后取出切屑外壳托架。将芯片从培养箱转移到生物安全柜后，取出剩余的培养基体积到顶部储液器中。
然后，从顶部微流体通道轻轻吸出所有介质，并使用粘合剂夹夹住连接到顶部入口的短微流体管，以减少介质蒸发和维持气液界面或ALI。将外壳载体上的开顶芯片放回培养箱中。将芯片重新连接到蠕动泵，并通过启动蠕动泵恢复流动。
用内皮细胞培养基冲洗血管室，然后接种25微升内皮细胞悬液。将芯片倒置，使内皮细胞附着在微流体室的上表面。将薯片分组到培养皿中。
如前所述，将它们放回培养箱中，让内皮细胞附着一小时。在孵育结束时，将芯片从培养箱转移到生物安全柜中，并用内皮细胞培养基冲洗血管通道两次以去除细胞碎片。将芯片平放，以促进内皮细胞粘附到血管通道的底面。
在生物安全柜下用脱气的维管细胞培养基填充血管培养基储液器。将芯片放回芯片外壳托架内，并将芯片重新连接到一端的介质储液罐和另一端的蠕动泵。检查微流体连接，以确保所有芯片都正确连接并且没有可见的介质滴落液滴。
然后，通过启动蠕动泵恢复流体流动。可视化有细胞和无细胞的微图案凝胶表面。组织学分析显示成熟的多层分层表皮在芯片上分化。
皮肤芯片的顶视图图片显示了真皮层内成纤维细胞的存在。PECAM-1，VE-钙粘蛋白和von Willebrand显示了在开顶皮肤芯片中共培养的人微血管内皮细胞的分化。MUC5AC、α 和 β 微管蛋白、氯细胞蛋白 16、p63 和 ZO-1 荧光染色显示气道上皮成熟。
在敞篷气道芯片上观察到跳动纤毛和分化的成熟假分层上皮。I型、II型和E-钙粘蛋白荧光染色显示芯片上存在成熟肺细胞。电子显微镜显示存在微绒毛和溶酶体囊泡，这是成熟肺泡表型的证据。
组织学分析显示存在与 I 型表型一致的扁平鳞状细胞，以及与 II 型表型一致的立方体鹅卵石样细胞，以及真皮层内的成纤维细胞。肠细胞和成熟杯子的存在通过粘蛋白2和E-钙粘蛋白染色得到证实。真皮层内的成纤维细胞证实了简单的柱状上皮的存在。
所有试剂必须冷，凝胶表面应充分冲洗以获得均匀的表面。重要的是去除任何非粘附细胞和碎片，以获得均匀的细胞粘附和紧凑的污垢单层和血管壁。类似的方法可用于生成其他类型的上皮器官模型，例如肠和肺，以评估特定药物或环境因素如何影响人体组织的稳态，特别强调上皮和血管屏障功能。
由于可以轻松进入基质隔室的功效阶段，研究现在可以生成特定的面部图案并重现功能性组织结构，例如cryptviveoli，这是其他设备难以实现的。
