CIRCLE-Seq 用于研究脱靶基因编辑

我们的团队致力于开发诱导多能干细胞 iPSC 疗法，用于治疗目前无法治愈的严重皮肤病，例如隐性营养不良性大疱性表皮松解症。我们的目标是确定精确的基因编辑与 iPSC 分化为皮肤细胞是否可以为这些情况提供可行的治疗选择。使用 CRISPR-Cas9 技术对体细胞和 iPSC 进行基因编辑，通过为各种疾病（包括遗传性皮肤病）提供个性化治疗，正在改变再生医学。

基因工程的当前挑战包括基因编辑器的脱靶效应。治疗需要基因编辑器在不改变基因组中任何其他位置的情况下精确校正目标基因。我们面临的挑战是证明基因编辑者不会在目标基因之外引入意外的编辑。

CIRCLE-seq 协议能够识别其他类似技术可能遗漏的真正潜在脱靶位点。对这些脱靶位点的全面分析为基因组编辑器的活动提供了有价值的见解，从而提高了基因疗法的安全性，包括我们基于 IPSC 的皮肤病疗法。诱导多能干细胞生长 5 天后，通过离心收集细胞并将其重悬于 10 毫升 PBS 中。

将 6 μL 细胞悬液与 6 μL 台盼蓝混合进行细胞计数。计数后，分装 2 次乘以 10 至每管 7 个细胞的幂。将细胞在 25 °C 下以 300 G 离心 3 分钟，然后弃去上清液。

通过归位控制臂来准备聚焦的超声仪。用纯净的去离子水填充水箱。在控制站笔记本电脑上，访问 Waterworks 并单击 Fill 开始填充系统。

将温度调整到 4.5 摄氏度。将从诱导多能干细胞中分离的 25 μg 基因组 DNA 转移到微管中。用 TE 缓冲液填充试管至总体积为 130 微升。

设置条件，将 DNA 剪切至平均长度为 300 个碱基对，持续时间为 10 秒，峰值功率为 70，占空比百分比为 20，循环突增为 50。将剪切的基因组 DNA 分成两份，每份 65 μL。使用 1.8 倍体积的 XP 珠子纯化样品，然后进行磁架分离。

将上清液转移到新的 PCR 板中，并使用分光光度计测量 DNA 数量。最后，在磁带站上运行一微升提到的剪切基因组 DNA。首先，在 TE 缓冲液中重悬 oSQT1288 和发夹接头至终浓度为 100 微摩尔。

对于接头退火，混合 40 μL oSQT1288、10 μL 10X STE 和 50 μL 无核酸酶水，使总体积达到 100 μL。接头退火后，混合 10 μL 5X 连接缓冲液、5 μL DNA 连接酶和 5 μL 退火发夹接头，将 20 μL 接头连接预混液移液到每个含有磁珠的洗脱 DNA 样本中。将样品放入 20 摄氏度的热循环仪中 1 小时，然后无限期地保持在 4 摄氏度。

接下来，将 50 μL PEG/NaCl 喷雾溶液转移到接头连接的 DNA 中。使用 XP 磁珠和磁力架分离纯化样品。用 30 μL pH 8 的 TE 缓冲液洗脱样品，并将上清液倒入新的半裙边 PCR 板中。

合并样品并使用 dsDNA BR 测定定量 DNA。要制备循环预混液，将 8 μL 无核酸酶水、10 μL 10X TD4 DNA 连接酶缓冲液和 2 μL T4 DNA 连接酶混合，总体积为 20 μL。将 20 微升环化预混液移液到 80 微升经用户 PNK 处理的 500 ng DNA 中。

将样品在 16 摄氏度的热循环仪中孵育 16 小时。第二天，向环化 DNA 中加入 100 μL XP 珠子并纯化样品，如前所述。用 38 μL TE 缓冲液洗脱样品，并将上清液倒入新的半裙边 PCR 板中。

要裂解纯化的环状基因组 DNA，将 5 μL 10X Cas9 缓冲液、4.5 μL 化脓性链球菌 Cas9 和 1.5 μL 基因组 RNA 混合，制备体外切割预混液，总体积为 11 μL。在室温下孵育切割预混液 10 分钟。形成 Cas9 gRNA RNP 复合物。

在无核酸酶的水中稀释 125 ng 质粒安全 DNase 处理的基因组 DNA，至最终体积为 39 μL。然后，向 39 μL DNA 中加入 11 μL 的切割预混液，使总体积为 50 μL。将混合物在热循环仪中于 37 摄氏度孵育 1 小时，并无限期地保持在 4 摄氏度。

孵育后，向体外裂解的 DNA 中加入 50 μL XP 珠子，并在磁力架上纯化 DNA。在 42 μL TE 缓冲液中洗脱纯化的 DNA。要分析下一代测序数据，请安装 Python 版本 2.7、Burrows-Wheeler Aligner 和 SAMtools。

从给定的网站下载参考基因组。定义参考基因组 FASTA 文件、用于分析的输出目录以及 BWA 和 SAMtools 命令的路径。指定核酸酶切割样品和对照样品的靶序列和解多路 FASTQ 文件的路径。

使用以下命令执行基于参考的标准分析。执行完整管道时，将每个步骤的输出结果放在为该特定步骤指定的不同输出文件夹中。