Nuestro equipo se dedica al desarrollo de terapias con células madre pluripotentes inducidas, iPSC, para enfermedades cutáneas graves y actualmente incurables, como la epidermólisis bullosa distrófica recesiva. Nuestro objetivo es determinar si la edición genética precisa, junto con la diferenciación de iPSC en células de la piel, puede proporcionar una opción de tratamiento viable para estas afecciones. La edición genética en células somáticas e iPSC mediante la tecnología CRISPR-Cas9 está transformando la medicina regenerativa al permitir terapias personalizadas para diversas enfermedades, incluidos los trastornos genéticos de la piel.
Los desafíos actuales en ingeniería genética incluyen los efectos fuera del objetivo de los editores de genes. La terapia requiere editores de genes que corrijan con precisión el gen de interés sin alterar ninguna otra ubicación en el genoma. Nuestro reto es demostrar que los editores de genes no introducen ediciones no intencionadas más allá del gen objetivo.
El protocolo CIRCLE-seq permite la identificación de posibles sitios fuera del objetivo de buena fe que otras técnicas similares podrían pasar por alto. Un análisis exhaustivo de estos sitios fuera del objetivo proporciona información valiosa sobre la actividad de los editores del genoma, lo que mejora la seguridad de las terapias génicas, incluida nuestra terapia basada en IPSC para enfermedades de la piel. Después de cultivar células madre pluripotentes inducidas durante cinco días, recoja las células por centrifugación y vuelva a suspenderlas en 10 mililitros de PBS.
Mezcle seis microlitros de suspensión celular en seis microlitros de azul de tripán para el recuento de células. Después de contar, alícuota dos por 10 elevado a siete celdas por tubo. Centrifugar las células a 300 g durante tres minutos a 25 grados centígrados y desechar el sobrenadante.
Prepare el ultrasonido enfocado apuntando el brazo de control. Llene el depósito con agua purificada y desionizada. En la computadora portátil de la estación de control, acceda a las obras hidráulicas y haga clic en llenar para comenzar a llenar el sistema.
Ajusta la temperatura a 4,5 grados centígrados. Transfiera 25 microgramos de ADN genómico aislado de células madre pluripotentes inducidas a un microtubo. Llene el tubo hasta un volumen total de 130 microlitros con tampón TE.
Establezca las condiciones para cortar el ADN en una longitud promedio de 300 pares de bases, una duración de 10 segundos, una potencia máxima de 70, un porcentaje de factor de trabajo de 20 y ciclos de ráfaga a 50. Divida el ADN genómico cortado en dos porciones de 65 microlitros cada una. Purifique las muestras utilizando 1,8 veces el volumen de las perlas XP, seguido de la separación magnética del estante.
Transfiera el sobrenadante a una nueva placa de PCR y mida la cantidad de ADN con un espectrofotómetro. Por último, haga funcionar un microlitro del ADN genómico de cizallamiento aludido en una estación de cinta. Para comenzar, vuelva a suspender oSQT1288 y el adaptador de horquilla hasta una concentración final de 100 micromolares en tampón TE.
Para el recocido del adaptador, mezcle 40 microlitros de oSQT1288, 10 microlitros de 10X STE y 50 microlitros de agua sin nucleasas para alcanzar un volumen total de 100 microlitros. Después del recocido del adaptador, mezcle 10 microlitros de tampón de ligadura 5X, cinco microlitros de ADN ligasa y cinco microlitros de adaptador de horquilla recocido, pipetee 20 microlitros de la mezcla maestra de ligadura del adaptador en cada muestra de ADN eluida que contenga perlas. Coloque las muestras en un termociclador a 20 grados centígrados durante una hora, luego manténgalas a cuatro grados centígrados indefinidamente.
A continuación, transfiera 50 microlitros de solución de pulverización de PEG/NaCl al ADN ligado al adaptador. Purifique las muestras utilizando perlas XP y separación magnética por rack. Eluir las muestras con 30 microlitros de tampón TE pH ocho y decantar los sobrenadantes en una nueva placa de PCR con semifaldón.
Combine las muestras y cuantifique el ADN utilizando el ensayo dsDNA BR. Para preparar la mezcla maestra de circularización, combine ocho microlitros de agua sin nucleasas, 10 microlitros de tampón de ADN ligasa TD4 10X y dos microlitros de ligasa de ADN T4 para un volumen total de 20 microlitros. Pipetear 20 microlitros de la mezcla maestra de circularización a 80 microlitros de 500 nanogramos de ADN tratado con PNK de usuario.
Incubar la muestra en un termociclador a 16 grados centígrados durante 16 horas. Al día siguiente, agregue 100 microlitros de perlas XP al ADN circularizado y purifique las muestras, como se demostró anteriormente. Eluir la muestra con 38 microlitros de tampón TE y decantar el sobrenadante en una nueva placa de PCR con semifaldón.
Para escindir el ADN genómico circularizado purificado, prepare la mezcla maestra de escisión in vitro combinando cinco microlitros de tampón 10X Cas9, 4,5 microlitros de Streptococcus pyogenes Cas9 y 1,5 microlitros de ARN genómico para un volumen total de 11 microlitros. Incuba la mezcla maestra de escisión a temperatura ambiente durante 10 minutos. para formar los complejos Cas9 gRNA RNP.
Diluir 125 nanogramos de ADN genómico tratado con DNasa seguro para plásmidos hasta un volumen final de 39 microlitros en agua libre de nucleasas. A continuación, añade 11 microlitros de la mezcla maestra de escisión a los 39 microlitros de ADN para obtener un volumen total de 50 microlitros. Incubar la mezcla en un termociclador durante una hora a 37 grados centígrados y mantenerla a cuatro grados centígrados indefinidamente.
Después de la incubación, agregue 50 microlitros de perlas XP al ADN escindido in vitro y purifique el ADN en un estante magnético. Eluir el ADN purificado en 42 microlitros de tampón TE. Para el análisis de datos de secuenciación de próxima generación, instale Python versión 2.7, Burrows-Wheeler Aligner y SAMtools.
Descargue el genoma de referencia desde el sitio web correspondiente. Defina el archivo FASTA del genoma de referencia, el directorio de salida para el análisis y las rutas de acceso a los comandos BWA y SAMtools. Especifique las secuencias de destino y las rutas de acceso a los archivos FASTQ demultiplexados para las muestras escindidas con nucleasa y de control.
Ejecute el análisis estándar basado en referencias mediante el siguiente comando. Al ejecutar la canalización completa, busque los resultados de salida de cada paso en una carpeta de salida distinta designada para ese paso específico.
