Наша команда занимается разработкой методов лечения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, iPSC, для тяжелых, в настоящее время неизлечимых кожных заболеваний, таких как рецессивный дистрофический буллезный эпидермолиз. Мы стремимся определить, может ли точное редактирование генов в сочетании с дифференцировкой iPSC в клетки кожи обеспечить жизнеспособный вариант лечения этих состояний. Редактирование генов в соматических клетках и ИПСК с использованием технологии CRISPR-Cas9 преобразует регенеративную медицину, позволяя создавать персонализированные методы лечения различных заболеваний, включая генетические нарушения кожи.
Современные проблемы генной инженерии включают в себя нецелевые эффекты редакторов генов. Для лечения требуются редакторы генов, которые точно корректируют интересующий ген, не изменяя никаких других мест в геноме. Наша задача состоит в том, чтобы продемонстрировать, что редакторы генов не вносят непреднамеренные изменения за пределы целевого гена.
Протокол CIRCLE-seq позволяет идентифицировать реальные потенциальные нецелевые сайты, которые другие подобные методы могли бы пропустить. Всесторонний анализ этих нецелевых сайтов дает ценную информацию о деятельности редакторов генома, повышая безопасность генной терапии, включая нашу терапию кожных заболеваний на основе IPSC. После выращивания индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в течение пяти дней соберите клетки центрифугированием и повторно суспендируйте их в 10 миллилитрах PBS.
Смешайте шесть микролитров клеточной суспензии с шестью микролитрами трипанового синего для подсчета клеток. После подсчета аликвоту два умножить на 10 в степени семи ячеек на трубку. Центрифугируйте клетки при 300 G в течение трех минут при 25 градусах Цельсия и выбросьте надосадочную жидкость.
Подготовьте сфокусированный ультразвуковой аппарат путем самонаведения управляющего рычага. Наполните резервуар очищенной, деионизированной водой. На ноутбуке станции управления получите доступ к водопроводным сооружениям и нажмите «Заполнить», чтобы начать заполнение системы.
Отрегулируйте температуру до 4,5 градусов по Цельсию. Перенесите 25 микрограммов геномной ДНК, выделенной из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, в микротрубку. Заполните тюбик до общего объема 130 микролитров TE-буфером.
Установите условия для сдвига ДНК до средней длины 300 пар оснований, продолжительности 10 секунд, пиковой мощности 70, коэффициента заполнения 20 и циклов разрыва до 50. Разделите срезанную геномную ДНК на две части по 65 микролитров каждая. Очистите образцы, используя в 1,8 раза больше объема шариков XP, с последующей сепарацией магнитной решетки.
Перенесите надосадочную жидкость на новую ПЦР-планшет и измерьте количество ДНК с помощью спектрофотометра. Наконец, запустите один микролитр упомянутой геномной ДНК сдвига на магнитную станцию. Для начала ресуспендируйте oSQT1288 и адаптер шпильки до конечной концентрации 100 микромоляров в TE-буфере.
Для отжига адаптером смешайте 40 микролитров oSQT1288, 10 микролитров 10X STE и 50 микролитров воды, не содержащей нуклеаз, чтобы получить общий объем 100 микролитров. После отжига адаптера смешайте 10 микролитров буфера для лигирования 5X, пять микролитров ДНК-лигазы и пять микролитров отожженного адаптера для шпильки, Пипетка смешайте 20 микролитров мастер-смеси лигирования адаптера в каждый элюированный образец ДНК, содержащий гранулы. Поместите образцы в амплификатор при температуре 20 градусов Цельсия на один час, затем подержите при температуре четыре градуса Цельсия на неопределенный срок.
Затем перенесите 50 микролитров раствора спрея PEG/NaCl на ДНК, лигированную адаптером. Очистите образцы с помощью шариков XP и магнитной сепарации. Разбавьте образцы 30 микролитрами TE-буфера pH eight и сцедите надосадочную жидкость в новую полузакрытую ПЦР-планшет.
Объедините образцы и количественно оцените ДНК с помощью анализа dsDNA BR. Для приготовления мастер-смеси циркуляризации соедините восемь микролитров воды, не содержащей нуклеаз, 10 микролитров 10X TD4 ДНК-лигазы и два микролитра T4 ДНК-лигазы для получения общего объема 20 микролитров. Пипетка 20 микролитров циркулярной мастер-смеси на 80 микролитров 500 нанограмм ДНК, обработанной пользователем PNK.
Инкубируйте образец в амплификаторе при температуре 16 градусов Цельсия в течение 16 часов. На следующий день добавьте 100 микролитров шариков XP в циркуляризованную ДНК и очистите образцы, как было показано ранее. Разбавьте образец 38 микролитрами TE-буфера и сцедите надосадочную жидкость в новую ПЦР-планшет с полуюбкой.
Чтобы расщепить очищенную циркуляризованную геномную ДНК, приготовьте мастер-смесь для расщепления in vitro, соединив пять микролитров 10-кратного буфера Cas9, 4,5 микролитра Streptococcus pyogenes Cas9 и 1,5 микролитра геномной РНК общим объемом 11 микролитров. Инкубируйте мастер-смесь для расщепления при комнатной температуре в течение 10 минут. для формирования комплексов РНК Cas9 гРНК.
Разбавьте 125 нанограммов безопасной для плазмид геномной ДНКазы, обработанной ДНКазой, до конечного объема 39 микролитров в воде, не содержащей нуклеаз. Затем добавьте 11 микролитров мастер-смеси для расщепления к 39 микролитрам ДНК в общем объеме 50 микролитров. Инкубируйте смесь в термоамплификаторе в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия и поддерживайте ее на уровне четырех градусов Цельсия в течение неопределенного времени.
После инкубации добавьте 50 микролитров шариков XP в расщепленную in vitro ДНК и очистите ДНК на магнитной стойке. Разбавьте очищенную ДНК в 42 микролитрах TE буфера. Для анализа данных секвенирования нового поколения установите Python версии 2.7, Burrows-Wheeler Aligner и SAMtools.
Загрузите референсный геном с данного сайта. Определите файл FASTA референсного генома, выходной каталог для анализа и пути к командам BWA и SAMtools. Укажите целевые последовательности и пути к демультиплексированным файлам FASTQ как для нуклеазно-расщепленных, так и для контрольных образцов.
Выполните стандартный анализ на основе ссылок с помощью следующей команды. При выполнении полного конвейера найдите выходные результаты каждого шага в отдельной выходной папке, предназначенной для этого конкретного шага.
