Il nostro team si dedica allo sviluppo di terapie con cellule staminali pluripotenti indotte, iPSC, per malattie cutanee gravi e attualmente incurabili, come l'epidermolisi bollosa distrofica recessiva. Il nostro obiettivo è determinare se l'editing genetico preciso accoppiato con la differenziazione delle iPSC in cellule della pelle possa fornire una valida opzione di trattamento per queste condizioni. L'editing genetico nelle cellule somatiche e nelle iPSC utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas9 sta trasformando la medicina rigenerativa consentendo terapie personalizzate per varie malattie, tra cui i disturbi genetici della pelle.
Le sfide attuali nell'ingegneria genetica includono gli effetti fuori bersaglio degli editor genetici. La terapia richiede editor genetici che correggano con precisione il gene di interesse senza alterare altre posizioni nel genoma. La nostra sfida è dimostrare che gli editor genetici non introducono modifiche non intenzionali oltre il gene bersaglio.
Il protocollo CIRCLE-seq consente l'identificazione di potenziali siti fuori bersaglio in buona fede che altre tecniche simili potrebbero non rilevare. Un'analisi completa di questi siti fuori bersaglio fornisce preziose informazioni sull'attività degli editor del genoma, migliorando la sicurezza delle terapie geniche, inclusa la nostra terapia basata su IPSC per le malattie della pelle. Dopo aver coltivato cellule staminali pluripotenti indotte per cinque giorni, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospenderle in 10 millilitri di PBS.
Mescolare sei microlitri di sospensione cellulare in sei microlitri di blu di tripano per la conta cellulare. Dopo il conteggio, aliquotare due volte 10 alla potenza di sette celle per provetta. Centrifugare le celle a 300 g per tre minuti a 25 gradi Celsius e scartare il surnatante.
Preparare l'ultrasuonatore focalizzato puntando il braccio di controllo. Riempire il serbatoio con acqua purificata e deionizzata. Sul laptop della stazione di controllo, accedi all'acquedotto e fai clic su Riempi per iniziare a riempire il sistema.
Regolare la temperatura a 4,5 gradi Celsius. Trasferire 25 microgrammi di DNA genomico isolato da cellule staminali pluripotenti indotte in una microprovetta. Riempire la provetta fino a un volume totale di 130 microlitri con tampone TE.
Imposta le condizioni per tranciare il DNA a una lunghezza media di 300 coppie di basi, una durata di 10 secondi, una potenza di picco di 70, una percentuale di fattore di servizio a 20 e cicli a 50. Dividi il DNA genomico tranciato in due porzioni da 65 microlitri ciascuna. Purificare i campioni utilizzando 1,8 volte il volume delle perle XP, seguito dalla separazione magnetica su rack.
Trasferire il surnatante in una nuova piastra PCR e misurare la quantità di DNA utilizzando uno spettrofotometro. Infine, eseguire un microlitro del DNA genomico a taglio alluso su una stazione a nastro. Per iniziare, risospendere oSQT1288 e l'adattatore a forcina a una concentrazione finale di 100 micromolari in tampone TE.
Per la ricottura dell'adattatore, mescolare 40 microlitri di oSQT1288, 10 microlitri di 10X STE e 50 microlitri di acqua priva di nucleasi per raggiungere un volume totale di 100 microlitri. Dopo la ricottura dell'adattatore, mescolare 10 microlitri di tampone di legatura 5X, cinque microlitri di DNA ligasi e cinque microlitri di adattatore per forcine ricotto, pipettare 20 microlitri della miscela master di legatura dell'adattatore in ciascun campione di DNA eluito contenente perline. Posizionare i campioni in un termociclatore a 20 gradi Celsius per un'ora, quindi mantenerli a quattro gradi Celsius a tempo indeterminato.
Successivamente, trasferire 50 microlitri di soluzione spray PEG/NaCl nel DNA legato con adattatore. Purificare i campioni utilizzando perle XP e la separazione magnetica su rack. Eluire i campioni con 30 microlitri di tampone TE pH otto e decantare i surnatanti in una nuova piastra PCR semi-gonnata.
Combinare i campioni e quantificare il DNA utilizzando il test dsDNA BR. Per preparare la miscela master di circolarizzazione, combinare otto microlitri di acqua priva di nucleasi, 10 microlitri di tampone DNA ligasi 10X TD4 e due microlitri di DNA ligasi T4 per un volume totale di 20 microlitri. Pipettare 20 microlitri della miscela master di circolarizzazione a 80 microlitri di 500 nanogrammi di DNA trattati con l'utente PNK.
Incubare il campione in un termociclatore a 16 gradi Celsius per 16 ore. Il giorno successivo, aggiungere 100 microlitri di perle XP al DNA circolarizzato e purificare i campioni, come dimostrato in precedenza. Eluire il campione con 38 microlitri di tampone TE e decantare il surnatante in una nuova piastra PCR semi-bordata.
Per scindere il DNA genomico circolarizzato purificato, preparare una master mix di scissione in vitro combinando cinque microlitri di tampone 10X Cas9, 4,5 microlitri di Streptococcus pyogenes Cas9 e 1,5 microlitri di RNA genomico per un volume totale di 11 microlitri. Incubare la miscela master di scissione a temperatura ambiente per 10 minuti. per formare i complessi RNP del gRNA Cas9.
Diluire 125 nanogrammi di DNA genomico trattato con DNasi sicuro per i plasmidi fino a un volume finale di 39 microlitri in acqua priva di nucleasi. Quindi, aggiungere 11 microlitri del mix master di scissione ai 39 microlitri di DNA per un volume totale di 50 microlitri. Incubare la miscela in un termociclatore per un'ora a 37 gradi Celsius e mantenerla a quattro gradi Celsius a tempo indeterminato.
Dopo l'incubazione, aggiungere 50 microlitri di perle XP al DNA scisso in vitro e purificare il DNA su una rastrelliera magnetica. Eluire il DNA purificato in 42 microlitri di tampone TE. Per l'analisi dei dati di sequenziamento di nuova generazione, installare Python versione 2.7, Burrows-Wheeler Aligner e SAMtools.
Scarica il genoma di riferimento dal sito Web indicato. Definire il file FASTA del genoma di riferimento, la directory di output per l'analisi e i percorsi dei comandi BWA e SAMtools. Specificare le sequenze target e i percorsi dei file FASTQ demultiplexati sia per i campioni di clivaggio della nucleasi che per quelli di controllo.
Eseguite l'analisi standard basata sui riferimenti utilizzando il comando seguente. Quando si esegue la pipeline completa, individuare i risultati di output di ogni passaggio in una cartella di output distinta designata per tale passaggio specifico.
