JP riconosce il sostegno finanziario del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada e del College of Medicine dell'Università del Saskatchewan. YD riconosce il sostegno finanziario del College of Medicine Startup Fund dell'Università del Saskatchewan, del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN-2023-03659), dell'MS Canada Catalyst Grant (1019973), del Saskatchewan Health Research Foundation Establishment Grant (6368) e del Brain Canada Foundation Future Leaders in Canadian Brain Research Grant. La Figura 1A, la Figura 2A e la Figura 3A sono state create con BioRender.com.

Tutti gli animali utilizzati in questo studio sono stati alloggiati e gestiti con l'approvazione dell'University Animal Care Committee (UACC) dell'Università del Saskatchewan e del Canadian Council on Animal Care (CCAC). Per questo studio sono stati utilizzati giorni post-natali 0-2 topi CD1 maschi e femmine e embrioni embrionali giorni 16-18 (E16-18) di topi CD1 gravidi. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Coltura primaria della microglia
NOTA: È fondamentale cronometrare le colture misti di glia e neuroni in modo che le microglia siano mature e pronte per il raccolto entro 2 giorni dopo che i neuroni sono stati seminati in una piastra a 96 pozzetti.
<ol><li>Preparazione<ol><li>Preriscaldare i terreni di coltura gliale completi, che includono il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco ad alto contenuto di glucosio integrato con il 10% di siero fetale bovino inattivato termicamente, 50 U/mL di penicillina/streptomicina con 2,92 mg/mL di L-glutammina, 1 mM di piruvato di sodio, 1 x aminoacidi non essenziali e 20 mM di HEPES in un bagno d'acqua a 37 °C.</li>
		<li>Aggiungere 5 mL di bromidrato di poli-L-ornitina (PO) da 10 μg/mL a ciascun matraccio T-75. Agitare delicatamente il pallone per assicurarsi che l'ordine di acquisto copra completamente il fondo del pallone. Incubare a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 per almeno 1 ora. NOTA: Questa fase di rivestimento è necessaria per facilitare l'adesione delle cellule ai palloni T-75.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento di cervelli da topi neonatali P0-P2 NOTA: Sterilizzare tutti gli strumenti di dissezione e mantenere la sterilità dei reagenti. Garantire l'aderenza alle tecniche asettiche in tutto il processo.<ol><li>Prima di iniziare la dissezione, spruzzare sul piano di lavoro con etanolo al 70% o spray disinfettante nel punto in cui avverrà la dissezione. Impostare il microscopio di dissezione e posizionare la capsula di Petri sotto il microscopio. Versare 20 mL di terreno L-15 di Leibovitz nella capsula di Petri. Tenere il coperchio della capsula di Petri quando il microscopio non è in uso per ridurre la contaminazione.</li>
		<li>Metti diversi strati di carta assorbente e spruzza accuratamente i tovaglioli di carta con etanolo al 70%. Preparare gli strumenti di dissezione (forbici da dissezione, un paio di micro-pinze e pinze per tessuti) spruzzandoli accuratamente con etanolo al 70% e appoggiando gli strumenti sui tovaglioli di carta.</li>
		<li>Trasferire il topo post-natale 0-2 sui tovaglioli di carta e spruzzare accuratamente il topo con etanolo al 70%. Decapitare il topo utilizzando le forbici da dissezione (seguendo i protocolli approvati istituzionalmente).</li>
		<li>Tenendo delicatamente la testa, creare un'incisione sulla linea mediana nel cranio partendo dal collo fino al naso. Stacca il cranio con una pinza per tessuti per rivelare il cervello.</li>
		<li>Usando una pinza per tessuti, estrai delicatamente il cervello inserendo la pinza sotto il cervello e solleva il cervello dalla testa. Inserire immediatamente il cervello nella capsula di Petri contenente 20 ml di terreno L-15 di Leibovitz.</li>
		<li>Al microscopio da dissezione, rimuovere con cautela il tronco encefalico e le meningi utilizzando un paio di micropinze. Raccogliere il cervello in una provetta conica da 50 mL contenente 5 mL di terreno L-15 di Leibovitz.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissociazione cerebrale, semina e mantenimento della coltura gliale mista NOTA: Eseguire tutti i passaggi successivi in una cabina di biosicurezza.<ol><li>Tritare il cervello in circa 1 mm2 pezzi con una lama di bisturi sterile usa e getta. Trasferire con cura i cervelli tritati in una nuova provetta sterile da 50 ml.</li>
		<li>Al cervello tritato, aggiungere una concentrazione finale di tripsina allo 0,25% e incubare il tessuto in un bagno d'acqua a 37 °C per 20 minuti. Ogni 2-3 minuti, mescolare la soluzione capovolgendo delicatamente il tubo per favorire la dissociazione dei tessuti.</li>
		<li>Dall'incubatore al 5% di CO2 , trasferire le fiasche T-75 contenenti 5 mL di PO nella cappa di biosicurezza. Scartare l'PO e sciacquare i palloni 3 volte con una soluzione tampone fosfato sterile 1x (PBS). Assicurarsi di sciacquare accuratamente le fiasche poiché l'eccesso di PO è tossico per le cellule.</li>
		<li>Trasferire il tessuto digerito dal bagnomaria a 37 °C nella cabina di biosicurezza. Aggiungere 5 mL di terreno di coltura gliale completo per neutralizzare la tripsina. Miscelare delicatamente la sospensione tissutale utilizzando una pipetta da 10 mL.</li>
		<li>Posizionare un colino sterile a rete di nylon da 70 μm su una provetta conica sterile da 50 ml e bagnare la rete versando circa 5 ml di L-15. Decantare con cura la sospensione cellulare attraverso il filtro cellulare. Rimuovere lo stantuffo da una siringa sterile da 1 ml, macinare il tessuto nella rete utilizzando lo stantuffo per eliminare i grumi di tessuto e generare una sospensione cellulare omogeneizzata.</li>
		<li>Periodicamente, versare circa 5 mL di terreno L-15 di Leibovitz nella rete di nylon da 70 μm e continuare a macinare il tessuto sulla rete con lo stantuffo della siringa da 1 mL. Quando rimane poco o nessun tessuto visibile sulla rete, scartare la rete e mettere da parte la sospensione cellulare.</li>
		<li>Miscelare la sospensione cellulare pipettando delicatamente su e giù. A ciascun pallone, aggiungere volumi uguali di sospensione cellulare contenente 1-2 cervelli con terreno di coltura gliale fino a un volume finale di 15 mL.</li>
		<li>Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 per una notte. Il giorno seguente, lavare le fiasche due volte con 1x PBS sterile per rimuovere cellule e detriti non attaccati.</li>
		<li>Aggiungere 15 mL di terreno di coltura gliale completo fresco alla coltura e incubare a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 . Dopo 3 giorni, sostituire metà del terreno con 10 mL di terreno di coltura gliale fresco integrati con 40 ng/mL di fattore stimolante le colonie di macrofagi (MCSF). NOTA: Successivamente, metà del terreno viene sostituito con 10 mL di terreno di coltura gliale fresco integrati con 40 ng/mL di MCSF ogni 3 giorni. La coltura viene mantenuta per 8-10 giorni prima che le microglia vengano raccolte.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Coltura neuronale primaria
<ol><li>Preparazione<ol><li>Scongelare l'integratore B-27 plus dal sistema di coltura neuronale B-27 plus. Terreno neurobasale più pre-riscaldato dal sistema di coltura neuronale B-27 plus, 1x Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) e siero fetale bovino inattivato termicamente (FBS) a 37 °C in un bagno d'acqua.</li>
		<li>Rivestire i matracci T-25 con 5 mL di 10 μg/mL di PO e incubare i flaconi per almeno 1 ora a 37 °C. Preparare gli strumenti e le forniture per la dissezione. NOTA: Questa fase di rivestimento facilita l'adesione delle cellule ai palloni T-25.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento cerebrale da embrioni di topo E16-E18 NOTA: Sterilizzare tutti gli strumenti di dissezione e mantenere la sterilità dei reagenti. Garantire l'aderenza alle tecniche asettiche in tutto il processo.<ol><li>Prima di iniziare la dissezione, spruzzare sul piano di lavoro con etanolo al 70% o spray disinfettante nel punto in cui avverrà la dissezione. Impostare il microscopio di dissezione e posizionare la capsula di Petri sotto il microscopio. Versare 20 mL di 1x HBSS nella capsula di Petri. Tenere il coperchio della capsula di Petri quando il microscopio non è in uso per ridurre la contaminazione.</li>
		<li>Metti diversi strati di carta assorbente e spruzza accuratamente i tovaglioli di carta con etanolo al 70%. Preparare gli strumenti di dissezione (forbici a molla, un paio di micro-pinze e pinze per tessuti) spruzzandoli accuratamente con etanolo al 70% e appoggiando gli strumenti sui tovaglioli di carta.</li>
		<li>Anestetizzare una topolina gravida tra i giorni di gestazione 16-18 usando isoflurano e sopprimere la topo mediante lussazione cervicale (seguendo protocolli istituzionalmente approvati).</li>
		<li>Appoggia il topo sulla schiena su un pezzo di carta assorbente imbevuto di etanolo al 70%. Disinfettare la zona addominale con etanolo al 70%. Sollevare la pelle del basso addome con una pinza per tessuti ed eseguire un'incisione a forma di V da questo punto alla gabbia toracica inferiore con le forbici da dissezione.</li>
		<li>Afferra le corna uterine che contengono gli embrioni con una pinza per tessuti e rimuovi delicatamente gli embrioni dalla cavità addominale. Disinfettare brevemente le corna uterine contenenti embrioni con etanolo al 70%.</li>
		<li>Sezionare un embrione dal suo sacco individuale alla volta. Usando le forbici a molla, crea un'incisione sulla linea mediana nella parte superiore del cranio, partendo dalla parte posteriore del collo fino al naso. Quindi, solleva il cranio dal sito di incisione per rivelare il cervello. Estrarre delicatamente il cervello con una pinza per tessuti e trasferire il cervello in una capsula di Petri da 10 cm contenente 15 ml di 1x HBSS.</li>
		<li>Sotto un microscopio da dissezione, rimuovere con cura il tronco encefalico e le meningi su entrambi i lati della corteccia cerebrale con un paio di micro-pinze. Trasferire le cortecce cerebrali in una provetta conica da 50 ml contenente 10 ml di 1x HBSS e metterle sul ghiaccio.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissociazione cerebrale e semina di neuroni corticali in coltura cellulare NOTA: Eseguire tutti i passaggi successivi in una cabina di biosicurezza.<ol><li>Tritare il cervello in circa 1 mm2 pezzi nella provetta conica da 50 ml con una lama di bisturi sterile monouso. Trasferire i cervelli tritati in una nuova provetta conica sterile da 50 mL.</li>
		<li>Aggiungere la tripsina alla provetta con una concentrazione finale dello 0,25%. Immergere la provetta in un bagno di acqua calda a 35-38 °C per 15 minuti e mescolare delicatamente la provetta per omogeneizzare il tessuto ogni 2-3 minuti.</li>
		<li>Estrarre il tubo dal bagno di acqua calda. Pipettare delicatamente la sospensione tissutale su e giù per dissociare ulteriormente le cellule, quindi aggiungere 0,5 ml di FBS inattivato dal calore alla sospensione omogeneizzata per neutralizzare l'attività della tripsina. Evitare le bolle d'aria per ridurre al minimo la tossicità per le cellule neuronali.</li>
		<li>Posizionare un colino sterile a rete di nylon da 70 μm su una provetta conica sterile da 50 ml e bagnare la rete aggiungendo circa 5 ml di terreno neurobasale. Filtrare la sospensione cellulare attraverso il filtro a rete di nylon da 70 μm. Utilizzando uno stantuffo della siringa da 1 mL, macinare delicatamente il tessuto nel colino cellulare. Versare periodicamente circa 5 mL di 1x HBSS continuando a macinare per lavare il filtro cellulare.</li>
		<li>Centrifugare la provetta conica a 300 x g per 5 min a 4 °C. Durante questo periodo, diluire l'integratore di B-27 plus in terreni neurobasali plus a una concentrazione finale pari a 1x da utilizzare come terreno neurobasale completo.</li>
		<li>Gettare l'PO nei matracci T-25 e sciacquare i flaconi tre volte con 5 ml di 1x PBS.</li>
		<li>Decantare con cura per rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare pipettando delicatamente su e giù 2-3 mL di terreno neurobasale completo. Determinare la concentrazione cellulare e il numero totale di cellule con un emocitometro e un blu di tripano. Aspettatevi fino a 1,0 x 107 cellule per embrione.</li>
		<li>Piastra le cellule nei flaconi di T-25 rivestiti in PO con circa 2,0 x 107 cellule per pallone in 5 ml di terreno neurobasale completo. Incubare la coltura cellulare a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 .</li>
		<li>Eseguire un mezzo cambio del terreno ogni 2-3 giorni sostituendo 2,5 mL di terreno dal pallone di coltura con un terreno neurobasale completo appena fatto.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Co-coltura di neuroni primari e microglia
NOTA: Tutti i passaggi successivi devono essere eseguiti in una cappa di biosicurezza sterile.
<ol><li>Semina di neuroni in piastre a 96 pozzetti<ol><li>Aggiungere 100 μl di 10 μg/ml di PO per pozzetto e incubare i palloni per almeno 1 ora a 37 °C per rivestire i pozzetti con PO. Lavare la piastra con 1x PBS 3 volte prima di seminare le cellule e aspirare il liquido rimanente dopo l'ultimo lavaggio.</li>
		<li>I neuroni cresciuti in fiasche di T-25 vengono raccolti per la co-coltura dopo 2-5 giorni di coltura. Sostituire il terreno con 5 mL di soluzione 1x Versene con tripsina allo 0,25% e 1 mg/mL di DNasi I per staccare i neuroni dal pallone. Posizionare i palloni all'interno dell'incubatore per 5-6 minuti per la digestione e agitare delicatamente il pallone ogni 2-3 minuti per favorire il distacco delle cellule.</li>
		<li>Estrarre il pallone dall'incubatrice e controllare se le cellule sono state staccate al microscopio. Aggiungere 0,5 mL di FBS inattivato termicamente per neutralizzare la tripsina e la DNasi I. Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 mL. Lavare il matraccio con 5 ml di terreno neurobasale completo una volta per massimizzare i neuroni raccolti. Raccogliere tutte le cellule nella stessa provetta conica da 15 mL.</li>
		<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere delicatamente il pellet cellulare in 2-3 mL di terreno neurobasale completo.</li>
		<li>Contare le cellule con un emocitometro e aggiungere un terreno neurobasale completo per ottenere una concentrazione finale di 7,5 x 105 neuroni/mL. Seminare 100 μl della sospensione cellulare in ciascun pozzetto nella piastra a 96 pozzetti rivestita in PO per ottenere 7,5 x 104 neuroni/pozzetto. Si prevede una resa di 5-6 milioni di neuroni per fiaschetta.</li>
		<li>Incubare i neuroni in una piastra a 96 pozzetti durante la notte. Aggiungere 100 μL di terreno neurobasale completo a ciascun pozzetto il giorno successivo. NOTA: Una volta che i neuroni mostrano un'appropriata crescita del processo neuritico (circa il giorno 3-4 dopo la semina in piastre a 96 pozzetti), sono pronti per la co-coltura con la microglia.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento e co-coltura microglia-neuronale<ol><li>Tra 8-10 giorni di coltura mista della glia, raccogliere le microglia lavando delicatamente i flaconi T-75 con terreni di coltura gliale in ciascun pallone con una pipetta da 10 ml e trasferire le cellule e i terreni in una provetta conica sterile da 50 ml. Lavare nuovamente i palloni con 10 mL di terreno di coltura gliale fresco per staccare altre microglia dai palloni e raccogliere il terreno. Si prevede una resa di 7,5 x 105 microglia per pallone.</li>
		<li>Aggiungere 20 mL di terreno di coltura gliale fresco integrato con 20 ng/mL di MCSF in ciascun pallone. Le microglia possono essere raccolte una o due volte se la coltura di glia mista viene mantenuta.</li>
		<li>Centrifugare la raccolta cellulare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere con cautela il surnatante e risospendere delicatamente il pellet in 2 mL di terreno neurobasale completo.</li>
		<li>Contare le cellule con un emocitometro e il blu di tripano. Aggiungere un terreno neurobasale completo a una concentrazione finale di 2,5 x 105 cellule/mL.</li>
		<li>Dalla piastra di coltura neuronale a 96 pozzetti, rimuovere 100 μL di terreno neurobasale e aggiungere 100 μL di sospensione cellulare 2,5 x 105 cellule/mL per seminare 2,5 x 104 microglia per pozzetto di 7,5 x 104 neuroni. Incubare la coltura per una notte a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 per consentire alla microglia di depositarsi. La co-coltura può ora essere utilizzata per esperimenti a valle.</li>
	</ol></li>
</ol>

 Protocollo di co-coltura primaria di microglia e neuroni per studi di interazione con il SNC

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Questo articolo descrive un protocollo per isolare e coltivare i neuroni primari di topo e la microglia primaria, che vengono successivamente utilizzati per stabilire una co-coltura microglia-neurone che può essere utilizzata per studiare come le interazioni tra microglia e neuroni regolano la loro salute e funzione cellulare. Questo approccio relativamente semplice e accessibile può fornire informazioni critiche sui meccanismi e sugli esiti funzionali delle interazioni dei neuroni della microglia nel SNC.
<p class...

Le microglia sono macrofagi residenti nei tessuti che facilitano l'immunosorveglianza e l'omeostasi nel sistema nervoso centrale (SNC)1,2,3. Originano dalle cellule progenitrici eritromieloidi del sacco vitellino che colonizzano il cervello durante lo sviluppo embrionale 4,5,6 e vengono mantenute per tutta la durata della vita dell'organismo attraverso l'autorinnovamento, che comporta la proliferazione e l'apoptosi7. Allo stato stazionario, le microglia a riposo hanno una morfologia ramificata e si impegnano nella sorveglianza dei tessuti 8,9,10.
Le microglia esprimono numerosi recettori della superficie cellulare, che consentono loro di rispondere rapidamente ai cambiamenti nel SNC11,12 e di promuovere risposte infiammatorie in caso di infezioni o lesioni tissutali 12,13,14, nonché durante le malattie neurodegenerative 9,15, come la sclerosi multipla (SM)16,17. Le microglia esprimono anche recettori per vari neurotrasmettitori e neuropeptidi 18,19,20, il che suggerisce che possono anche rispondere e regolare l'attività neuronale 21,22. Infatti, la microglia e i neuroni interagiscono in varie forme di comunicazione bidirezionale 8,23 come le interazioni dirette mediate dalle proteine di membrana o le interazioni indirette attraverso fattori solubili o cellule intermedie23,24.
Ad esempio, vari neurotrasmettitori secreti dai neuroni possono modulare l'attività neuroprotettiva o infiammatoria della microglia 25,26,27. Inoltre, le interazioni dirette tra i neuroni e la microglia aiutano a mantenere la microglia in uno stato omeostatico28. Al contrario, le interazioni dirette della microglia con i neuroni possono modellare i circuiti neuronali29 e influenzare la segnalazione neuronale 30,31,32. Poiché le interruzioni di queste interazioni inducono ipereccitabilità dei neuroni30 e reattività della microglia33,34, le interazioni disregolate microglia-neuroni sono implicate come fattore che contribuisce alle malattie neurologiche33,35. Infatti, è stato descritto che le malattie psicotiche23,26 e neurodegenerative mostrano interazioni disfunzionali microglia-neuroni33. Sebbene queste osservazioni evidenzino l'importanza della comunicazione microglia-neuroni nel SNC, i meccanismi specifici di come queste interazioni regolano le funzioni microgliali e neuronali in salute e malattia sono relativamente sconosciuti.
All'interno di un ambiente complesso come il SNC, molteplici fattori ambientali possono influenzare le interazioni microglia-neuronali, il che limita la capacità di studiare le interazioni cellulari transitorie in vivo. Qui, presentiamo un sistema di co-coltura microglia-neuroni in vitro che può essere utilizzato per studiare le interazioni cellulari dirette tra microglia e neuroni. Questo protocollo descrive la generazione di microglia primarie e neuroni dalle cortecce di topi neonatali tra i giorni post-natali 0-2 e i giorni 16-18 dei topi embrionali, rispettivamente. I neuroni e la microglia vengono quindi co-coltivati in piastre da 96 pozzetti per esperimenti ad alto rendimento a valle. In precedenza abbiamo utilizzato questo approccio per dimostrare che la fagocitosi della microglia protegge i neuroni dalla morte cellulare mediata dalla fosfatidilcolina ossidata37, suggerendo che questo metodo può aiutare a comprendere i ruoli della microglia nel contesto della neurodegenerazione e della SM. Allo stesso modo, le co-colture microglia-neuroni possono anche essere utili per studiare l'impatto del crosstalk microglia-neuronale in altri contesti come le infezioni virali38 o il danno e la riparazione neuronale39. Nel complesso, i sistemi di co-coltura microglia-neuroni in vitro consentono ai ricercatori di studiare le interazioni microglia-neuroni in un ambiente manipolabile e controllato, che integra i modelli in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm Petri dish&#160;</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>07-202-011</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Versene</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Plus Neuronal Culture System&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>A3653401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 Medium (1x)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony stimulating factor&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11020-11</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH3023801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin Glutamine (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>103780-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S11008-42</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>08-916-5D</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-126-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flasks&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-680-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Codman</td>
			<td>30-4218</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S12052-10</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue&#160;</td>
			<td>Thermofisher Sci&#160;</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%)</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Immunofluorescence Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating and co-culturing murine primary microglia and cortical neurons

Le microglia sono macrofagi residenti nei tessuti del sistema nervoso centrale (SNC) che svolgono numerose funzioni che supportano la salute neuronale e l'omeostasi del SNC. Sono una delle principali popolazioni di cellule immunitarie associate all'attività della malattia del SNC, adottando fenotipi reattivi che potenzialmente contribuiscono al danno neuronale durante le malattie neurodegenerative croniche come la sclerosi multipla (SM). I meccanismi distinti con cui le microglia regolano la funzione neuronale e la sopravvivenza durante la salute e la malattia rimangono limitati a causa delle sfide nella risoluzione delle complesse interazioni in vivo tra microglia, neuroni e altri fattori ambientali del SNC. Pertanto, l'approccio in vitro di co-coltura di microglia e neuroni rimane uno strumento prezioso per lo studio delle interazioni microglia-neuroni. Qui, presentiamo un protocollo per generare e co-coltivare microglia primarie e neuroni da topi. In particolare, le microglia sono state isolate dopo 9-10 giorni in vitro da una coltura gliale mista stabilita da omogenati cerebrali derivati da topi neonati tra i giorni post-natali 0-2. Le cellule neuronali sono state isolate da cortecce cerebrali di embrioni di topo tra i giorni embrionali 16-18. Dopo 4-5 giorni in vitro, le cellule neuronali sono state seminate in piastre a 96 pozzetti, seguite dall'aggiunta di microglia per formare la co-coltura. Un'attenta tempistica è fondamentale per questo protocollo, poiché entrambi i tipi di cellule devono raggiungere la maturità sperimentale per stabilire la co-coltura. Nel complesso, questa co-coltura può essere utile per studiare le interazioni microglia-neurone e può fornire più letture, tra cui la microscopia a immunofluorescenza, l'imaging dal vivo e i saggi di RNA e proteine.

Microglia are tissue-resident macrophages that facilitate immunosurveillance and homeostasis in the central nervous system (CNS)1,2,3. They originate from yolk sac erythromyeloid progenitor cells that colonize the brain during embryonic development4,5,6&#160;and are maintained throughout the organism&#39;s life span through self-renewal, which involves proliferation and apoptosis7. At steady-state, resting microglia have ramified morphology and engage in tissue surveillance8,9,10.
Microglia express numerous cell-surface receptors, which enables them to rapidly respond to changes in the CNS11,12 and to promote inflammatory responses in the event of infections or tissue injury12,13,14, as well as during neurodegenerative diseases9,15, such as&#160;multiple sclerosis (MS)16,17. Microglia also express receptors to various neurotransmitters and neuropeptides18,19,20, which suggests they may also respond to and regulate neuronal activity21,22. Indeed, microglia and neurons interact in various forms of bidirectional communication8,23 such as direct interactions mediated by membrane proteins or indirect interactions through soluble factors or intermediate cells23,24.
For instance, various neurotransmitters secreted by neurons can modulate the neuroprotective or inflammatory activity of microglia25,26,27. Additionally, direct interactions between neurons and microglia help to maintain microglia in a homeostatic state28. Conversely, direct interactions of microglia with neurons can shape neuronal circuitry29 and influence neuronal signaling30,31,32. As disruptions of these interactions induce hyperexcitability of neurons30 and&#160;microglia reactivity33,34, dysregulated microglia-neuronal interactions&#160;are implicated&#160;as a contributing factor to&#160;neurological diseases33,35. Indeed, psychotic23,26 and neurodegenerative diseases have been described to exhibit dysfunctional microglia-neuronal interactions33. While these observations highlight the importance of microglia-neuronal communication in the CNS, specific mechanisms of how these interactions regulate microglial and neuronal functions in health and disease are relatively unknown.
Within a complex milieu such as the CNS, multiple environmental factors can influence microglia-neuronal interactions, which limits the ability to study transient cellular interactions in vivo. Here, we present an in vitro microglia-neuronal co-culture system that can be used to study direct cellular interactions between microglia and neurons. This protocol describes the generation of primary microglia and neurons from the cortices of neonatal mice between post-natal days 0-2 and embryonic mice days 16-18, respectively. Neurons and microglia are then co-cultured in 96-well plates for downstream high-throughput experiments. We previously used this approach to demonstrate that microglia phagocytosis protects neurons from oxidized phosphatidylcholine mediated cell death37, suggesting that this method can help to understand the roles of microglia in the context of neurodegeneration and MS. Similarly, microglia-neuronal co-cultures may also be useful for investigating the impact of microglia-neuronal crosstalk in other contexts such as viral infections38 or neuronal injury and repair39. Overall, in vitro microglia-neuronal co-culture systems&#160;enable researchers to study microglia-neuronal interactions in a manipulatable and controlled environment, which complements in vivo models.

Autore in primo piano: Modello di co-coltura in vitro per lo studio delle interazioni microglia-neuroni in condizioni di malattia

Generazione e co-coltura di microglia primarie murine e neuroni corticali

Our research aims to investigate the interactions between neurons and microglia during disease conditions such as multiple sclerosis. We aim to recapitulate microglia neuronal interactions in vitro to better understand their functional importance in the CNS. We previously demonstrated that microglia phagocytosis protects neurons from oxidized phosphatidylcholine-mediated cell death with this co-culture.While other co-culture systems are also employed, this mixed culture system enables direct and close contact between microglia and neurons. In addition, it can remain healthy from 12 days to potentially three weeks, allowing for long-term studies of neuronal microglia interactions. Our protocol offers a simple and accessible method to co-culture microglia neurons that are easily manipulatable and can be further used in downstream assays to determine cellular functional changes.

Un diagramma di flusso che mostra le fasi chiave della coltura di glia mista per la microglia è mostrato nella Figura 1A. Nel complesso, il giorno 1 sono previste cellule sparse e detriti cellulari eccessivi (Figura 1B). Entro il 4° giorno, si dovrebbe osservare un aumento del numero di cellule, specialmente con la generazione di astrociti aderenti, come indicato dalla loro morfologia allungata (Figura 1C). Alcune microglia posson...

Questo protocollo descrive una co-coltura microglia-neuronale stabilita da cellule neuronali primarie isolate da embrioni di topo ai giorni embrionali 15-16 e microglia primaria generata dal cervello di topi neonatali nei giorni post-natali 1-2.

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS ...

generating-co-culturing-murine-primary-microglia-cortical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

628 Views.  University of Saskatchewan. La nostra ricerca mira a studiare le interazioni tra neuroni e microglia durante condizioni patologiche come la sclerosi multipla. Il nostro obiettivo è quello di ricapitolare le interazioni neuronali delle microglia in vitro per comprendere meglio la loro importanza funzionale nel SNC. Abbiamo precedentemente dimostrato che la fagocitosi della microglia protegge i neuroni dalla morte cellulare ossidata mediata dalla fosfatidilcolina con questa co-coltura.