JP remercie le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada et le Collège de médecine de l’Université de la Saskatchewan pour leur soutien financier. YD remercie le Fonds de démarrage du Collège de médecine de l’Université de la Saskatchewan, la Subvention à la découverte du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (RGPIN-2023-03659), la Subvention catalyseur de MS Canada (1019973), la Subvention d’établissement de la Fondation de la recherche en santé de la Saskatchewan (6368) et la Subvention pour les futurs leaders en recherche sur le cerveau au Canada de la Fondation Brain Grain. Les figures 1A, 2A et 3A ont été créées avec BioRender.com.

Tous les animaux utilisés dans cette étude ont été logés et manipulés avec l’approbation du Comité universitaire de protection des animaux (CCAC) de l’Université de la Saskatchewan et du Conseil canadien de protection des animaux (CCPA). Des souris mâles et femelles CD1 postnatales de jours 0 à 2 et des embryons embryonnaires de souris CD1 enceintes de jours 16 à 18 (E16-18) ont été utilisés pour cette étude. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisé sont répertoriés dans la table des matériaux.
1. Culture de microglie primaire
REMARQUE : Il est crucial de chronométrer les cultures mixtes de cellules gliales et neuronales afin que les microglies soient matures et prêtes à être récoltées dans les 2 jours suivant l’ensemencement des neurones dans une plaque de 96 puits.
<ol><li>Préparation<ol><li>Milieu de culture gliale complet préchauffé, qui comprend le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco avec une teneur élevée en glucose complété par 10 % de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur, 50 U/mL de pénicilline/streptomycine avec 2,92 mg/mL de L-glutamine, 1 mM de pyruvate de sodium, 1 x acides aminés non essentiels et 20 mM de HEPES dans un bain-marie à 37 °C.</li>
		<li>Ajouter 5 mL de bromhydrate de poly-L-ornithine (PO) de 10 μg/mL dans chaque fiole T-75. Agitez doucement le ballon pour vous assurer que le PO recouvre complètement le fond du ballon. Incuber à 37 °C dans un incubateur à 5% de CO2 pendant au moins 1 h. REMARQUE : Cette étape de revêtement est nécessaire pour faciliter l’adhérence des cellules aux flacons T-75.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolement du cerveau de souris nouveau-natales P0-P2 REMARQUE : Stérilisez tous les outils de dissection et maintenez la stérilité des réactifs. Assurer le respect des techniques d’asepsie tout au long du processus.<ol><li>Avant de commencer la dissection, vaporisez le comptoir avec de l’éthanol à 70 % ou un spray désinfectant à l’endroit où la dissection aura lieu. Installez le microscope de dissection et placez la boîte de Pétri sous le microscope. Versez 20 ml de milieu L-15 de Leibovitz dans la boîte de Pétri. Gardez le couvercle de la boîte de Pétri allumé lorsque le microscope n’est pas utilisé pour réduire la contamination.</li>
		<li>Placez plusieurs couches d’essuie-tout et vaporisez soigneusement les essuie-tout avec de l’éthanol à 70 %. Préparez les outils de dissection (ciseaux de dissection, une paire de micro-pinces et une pince à tissus) en les vaporisant soigneusement avec de l’éthanol à 70 % et en posant les outils sur les serviettes en papier.</li>
		<li>Transférez la souris postnatale des jours 0 à 2 sur les serviettes en papier et vaporisez soigneusement la souris avec de l’éthanol à 70%. Décapitez la souris à l’aide de ciseaux de dissection (en suivant les protocoles approuvés par l’établissement).</li>
		<li>Tout en tenant doucement la tête, créez une incision médiane dans le crâne en partant du cou vers le nez. Pelez le crâne avec une pince à tissu pour révéler le cerveau.</li>
		<li>À l’aide d’une pince à tissus, retirez doucement le cerveau en insérant la pince sous le cerveau et soulevez le cerveau de la tête. Placez immédiatement le cerveau dans la boîte de Pétri contenant 20 ml de L-15 de Leibovitz.</li>
		<li>À l’aide d’un microscope de dissection, retirez soigneusement le tronc cérébral et les méninges à l’aide d’une paire de micro-pinces. Prélever les cerveaux dans un tube conique de 50 ml contenant 5 ml de milieu L-15 de Leibovitz.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissociation du cerveau, ensemencement et maintien de la culture gliale mixte REMARQUE : Effectuez toutes les étapes subséquentes dans une enceinte de biosécurité.<ol><li>Hachez les cerveaux en morceaux d’environ 1 mm2 avec une lame de scalpel stérile et jetable. Transférez soigneusement les cerveaux hachés dans un nouveau tube stérile de 50 ml.</li>
		<li>Aux cerveaux hachés, ajoutez une concentration finale de 0,25 % de trypsine et incubez le tissu dans un bain-marie à 37 °C pendant 20 min. Toutes les 2-3 minutes, mélangez la solution en inversant doucement le tube pour faciliter la dissociation des tissus.</li>
		<li>À partir de l’incubateur à 5 % de CO2 , transvaser les flacons T-75 contenant 5 mL d’OO dans l’enceinte de biosécurité. Jetez le PO et rincez les flacons 3 fois avec une solution tampon de phosphate stérile 1x (PBS). Assurez-vous de bien rincer les flacons, car l’excès de PO est toxique pour les cellules.</li>
		<li>Transférez le tissu digéré du bain-marie à 37 °C dans l’enceinte de biosécurité. Ajouter 5 mL de milieu de culture gliale complet pour neutraliser la trypsine. Mélangez délicatement la suspension tissulaire à l’aide d’une pipette de 10 ml.</li>
		<li>Placez une crépine stérile en nylon de 70 μm sur un tube conique stérile de 50 mL et mouillez le treillis en versant environ 5 mL de L-15. Décanter soigneusement la suspension cellulaire à travers la crépine de cellule. Retirez le piston d’une seringue stérile de 1 ml, broyez le tissu dans le filet à l’aide du piston pour éliminer les amas de tissus et générez une suspension cellulaire homogénéisée.</li>
		<li>De temps en temps, versez environ 5 ml de média L-15 de Leibovitz dans le treillis en nylon de 70 μm et continuez à broyer le tissu sur le treillis avec le piston de seringue de 1 mL. Lorsqu’il reste peu ou pas de tissu visible sur le treillis, jetez le treillis et mettez la suspension cellulaire de côté.</li>
		<li>Mélangez la suspension cellulaire en pipetant doucement de haut en bas. Dans chaque flacon, ajouter des volumes égaux de suspension cellulaire contenant 1 à 2 cerveaux avec un milieu de culture gliale jusqu’à un volume final de 15 ml.</li>
		<li>Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 pendant la nuit. Le lendemain, lavez les flacons deux fois avec du PBS stérile 1x pour éliminer les cellules détachées et les débris.</li>
		<li>Ajouter 15 mL de milieu de culture glique complet frais à la culture et incuber à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 . Après 3 jours, remplacer la moitié du milieu par 10 ml de milieu de culture glique frais complété par 40 ng/mL de facteur de stimulation des colonies de macrophages (MCSF). REMARQUE : Par la suite, la moitié du milieu est remplacée par 10 mL de milieu de culture gliale frais complété par 40 ng/mL de MCSF tous les 3 jours. La culture est maintenue pendant 8 à 10 jours avant que les microglies ne soient récoltées.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Culture de neurones primaires
<ol><li>Préparation<ol><li>Décongeler B-27 plus supplément de B-27 plus système de culture neuronale. Préchauffage du milieu neurobasal plus à partir du système de culture neuronale B-27, 1x solution saline équilibrée de Hank (HBSS) et sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur (FBS) à 37 °C dans un bain-marie.</li>
		<li>Enduire les flacons T-25 de 5 mL de PO de 10 μg/mL et incuber les flacons pendant au moins 1 heure à 37 °C. Préparer les instruments et les fournitures pour la dissection. REMARQUE : Cette étape de revêtement facilite l’adhérence des cellules aux flacons T-25.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolement cérébral à partir d’embryons de souris E16-E18 REMARQUE : Stérilisez tous les outils de dissection et maintenez la stérilité des réactifs. Assurer le respect des techniques d’asepsie tout au long du processus.<ol><li>Avant de commencer la dissection, vaporisez le comptoir avec de l’éthanol à 70 % ou un spray désinfectant à l’endroit où la dissection aura lieu. Installez le microscope de dissection et placez la boîte de Pétri sous le microscope. Versez 20 ml de 1x HBSS dans la boîte de Pétri. Gardez le couvercle de la boîte de Pétri allumé lorsque le microscope n’est pas utilisé pour réduire la contamination.</li>
		<li>Placez plusieurs couches d’essuie-tout et vaporisez soigneusement les essuie-tout avec de l’éthanol à 70 %. Préparez les outils de dissection (ciseaux à ressort, une paire de micro-pinces et des pinces à tissus) en les vaporisant soigneusement avec de l’éthanol à 70 % et en posant les outils sur les serviettes en papier.</li>
		<li>Anesthésier une souris enceinte entre les jours 16 à 18 de gestation à l’aide d’isoflurane et euthanasier la souris par luxation cervicale (selon les protocoles approuvés par l’établissement).</li>
		<li>Posez la souris sur le dos sur un morceau de papier absorbant imbibé d’éthanol à 70 %. Désinfectez la zone abdominale avec de l’éthanol à 70%. Soulevez la peau du bas-ventre avec des pinces à tissus et effectuez une incision en forme de V à partir de ce point vers la cage thoracique inférieure avec des ciseaux de dissection.</li>
		<li>Saisissez les cornes utérines contenant les embryons à l’aide d’une pince à tissus et retirez délicatement les embryons de la cavité abdominale. Désinfectez brièvement les cornes utérines contenant des embryons avec de l’éthanol à 70%.</li>
		<li>Disséquez un embryon de son sac individuel à la fois. À l’aide de ciseaux à ressort, créez une incision médiane en haut du crâne, en partant de l’arrière du cou jusqu’au nez. Ensuite, soulevez le crâne loin du site d’incision pour révéler le cerveau. Prélevez doucement le cerveau à l’aide d’une pince à tissus et transférez le cerveau dans une boîte de Pétri de 10 cm contenant 15 ml de 1x HBSS.</li>
		<li>À l’aide d’un microscope à dissection, retirez soigneusement le tronc cérébral et les méninges des deux côtés du cortex cérébral à l’aide d’une paire de micro-pinces. Transférez les cortex cérébraux dans un tube conique de 50 ml contenant 10 ml de 1x HBSS et placez-le sur de la glace.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissociation cérébrale et ensemencement des neurones corticaux en culture cellulaire REMARQUE : Effectuez toutes les étapes subséquentes dans une enceinte de biosécurité.<ol><li>Hachez le cerveau en morceaux d’environ 1 mm2 dans le tube conique de 50 ml à l’aide d’une lame de scalpel stérile et jetable. Transférez les cerveaux hachés dans un nouveau tube conique stérile de 50 ml.</li>
		<li>Ajouter la trypsine dans le tube avec une concentration finale de 0,25%. Plongez le tube dans un bain d’eau chaude à 35-38 °C pendant 15 min et mélangez doucement le tube pour homogénéiser le tissu toutes les 2-3 min.</li>
		<li>Sortez le tube du bain d’eau chaude. Pipetez doucement la suspension tissulaire de haut en bas pour dissocier davantage les cellules, puis ajoutez 0,5 ml de FBS inactivé par la chaleur à la suspension homogénéisée pour neutraliser l’activité de la trypsine. Évitez les bulles d’air pour minimiser la toxicité pour les cellules neuronales.</li>
		<li>Placez une passoire stérile en nylon de 70 μm sur un tube conique stérile de 50 ml et mouillez le filet en ajoutant environ 5 ml de milieu neurobasal. Filtrez la suspension cellulaire à travers la crépine à mailles de nylon de 70 μm. À l’aide d’un piston de seringue de 1 ml, broyez doucement le tissu dans la crépine cellulaire. Versez périodiquement environ 5 ml de 1x HBSS tout en continuant à broyer pour laver la crépine de la cellule.</li>
		<li>Centrifuger le tube conique à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Pendant ce temps, diluez le supplément de B-27 plus dans les milieux neurobasaux plus à 1x la concentration finale pour l’utiliser comme milieu neurobasal complet.</li>
		<li>Jeter le PO dans les flacons T-25 et rincer les flacons trois fois avec 5 mL de 1x PBS.</li>
		<li>Décanter soigneusement pour éliminer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire en pipetant doucement de haut en bas sur 2 à 3 ml de milieu neurobasal complet. Déterminez la concentration cellulaire et le nombre total de cellules à l’aide d’un hémocytomètre et d’un bleu trypan. Attendez-vous à ce que jusqu’à 1,0 x 107 cellules par embryon.</li>
		<li>Plaquez les cellules dans les fioles T-25 enrobées de PO avec environ 2,0 x 107 cellules par fiole dans 5 ml de milieu neurobasal complet. Incuber la culture cellulaire à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 .</li>
		<li>Effectuez un demi-changement de milieu tous les 2-3 jours en remplaçant 2,5 ml de milieu du flacon de culture par un milieu neurobasal complet fraîchement préparé.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Co-culture de neurones primaires et de microglie
REMARQUE : Toutes les étapes subséquentes doivent être effectuées dans une enceinte de biosécurité stérile.
<ol><li>Ensemencement de neurones dans des plaques à 96 puits<ol><li>Ajouter 100 μL de 10 μg/mL d’OO par puits et incuber les flacons pendant au moins 1 h à 37 °C pour enrober les puits d’O. Lavez la plaque avec 1x PBS 3 fois avant d’ensemencer les cellules et aspirez tout liquide restant après le dernier lavage.</li>
		<li>Les neurones cultivés dans des flacons T-25 sont récoltés pour la co-culture après 2 à 5 jours de culture. Remplacer le milieu par 5 mL de solution 1x Versene avec 0,25 % de trypsine et 1 mg/mL de DNase I pour détacher les neurones du ballon. Placez les flacons à l’intérieur de l’incubateur pendant 5 à 6 minutes pour la digestion et remuez doucement le ballon toutes les 2 à 3 minutes pour faciliter le détachement des cellules.</li>
		<li>Sortez la fiole de l’incubateur et vérifiez si les cellules sont détachées au microscope. Ajouter 0,5 mL de FBS inactivé par la chaleur pour neutraliser la trypsine et la DNase I. Transférer les cellules dans un tube conique de 15 mL. Lavez une fois le flacon avec 5 ml de milieu neurobasal complet pour maximiser les neurones collectés. Rassemblez toutes les cellules dans le même tube conique de 15 ml.</li>
		<li>Centrifuger la suspension cellulaire à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre doucement la pastille cellulaire en suspension dans 2 à 3 mL de milieu neurobasal complet.</li>
		<li>Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et ajoutez un milieu neurobasal complet pour obtenir une concentration finale de 7,5 x 105 neurones/mL. Semez 100 μL de suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque à 96 puits recouverte d’un PO pour obtenir 7,5 x 104 neurones/puits. Un rendement de 5 à 6 millions de neurones par flacon est attendu.</li>
		<li>Incuber les neurones dans une plaque à 96 puits pendant la nuit. Ajouter 100 μL de milieu neurobasal complet dans chaque puits le lendemain. REMARQUE : Une fois que les neurones présentent une croissance appropriée du processus de neurites (environ 3-4 jours après l’ensemencement dans des plaques de 96 puits), ils sont prêts pour la co-culture avec la microglie.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolement et co-culture microgliale-neuronale<ol><li>Entre 8 et 10 jours de culture mixte de cellules gliales, prélever les cellules microgliales en lavant délicatement les flacons T-75 avec des milieux de culture gliale dans chaque flacon avec une pipette de 10 ml, et transférer les cellules et les milieux dans un tube conique stérile de 50 ml. Lavez de nouveau les flacons avec 10 mL de milieu de culture glique frais pour détacher les microglies supplémentaires des flacons et recueillir les milieux. Un rendement de 7,5 x 105 microglies par flacon est attendu.</li>
		<li>Ajouter 20 mL de milieu de culture glique frais complété par 20 ng/mL de MCSF dans chaque flacon. La microglie peut être récoltée une ou deux fois de plus si la culture de cellules gliales mixtes est maintenue.</li>
		<li>Centrifuger la collection de cellules à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirez délicatement le surnageant et remettez doucement la pastille en suspension dans 2 mL de milieu neurobasal complet.</li>
		<li>Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et d’un bleu trypan. Ajouter un milieu neurobasal complet à une concentration finale de 2,5 x 105 cellules/mL.</li>
		<li>De la plaque de culture neuronale à 96 puits, prélever 100 μL de milieu neurobasal et ajouter 100 μL de suspension cellulaire 2,5 x 105 cellules/mL à l’ensemencement de 2,5 x 104 microglies par puits de 7,5 x 104 neurones. Incuber la culture pendant la nuit à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 pour permettre à la microglie de se déposer. La co-culture peut maintenant être utilisée pour des expériences en aval.</li>
	</ol></li>
</ol>

 Protocole de co-culture de microglie primaire et de neurones pour les études d’interaction avec le SNC

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Cet article décrit un protocole permettant d’isoler et de cultiver des neurones primaires et des microglies primaires de souris, qui sont ensuite utilisés pour établir une co-culture microglie-neuronale qui peut être utilisée pour étudier comment les interactions microgliales et neuronales régulent leur santé et leur fonction cellulaires. Cette approche relativement simple et accessible peut fournir des informations essentielles sur les mécanismes et les résultats fonctionnels des interactions des neurones mi...

Les microglies sont des macrophages résidants dans les tissus qui facilitent l’immunosurveillance et l’homéostasie dans le système nerveux central (SNC)1,2,3. Ils proviennent de cellules progénitrices érythromyéloïdes du sac vitellin qui colonisent le cerveau pendant le développement embryonnaire 4,5,6 et sont maintenues tout au long de la vie de l’organisme par l’auto-renouvellement, ce qui implique la prolifération et l’apoptose7. À l’état d’équilibre, les microglies au repos ont une morphologie ramifiée et s’engagent dans la surveillance tissulaire 8,9,10.
Les microglies expriment de nombreux récepteurs à la surface des cellules, ce qui leur permet de réagir rapidement aux modifications du SNC11,12 et de favoriser les réponses inflammatoires en cas d’infections ou de lésions tissulaires 12,13,14, ainsi que lors de maladies neurodégénératives 9,15, telles que la sclérose en plaques (SEP)16,17. Les microglies expriment également des récepteurs à divers neurotransmetteurs et neuropeptides 18,19,20, ce qui suggère qu’elles peuvent également répondre et réguler l’activité neuronale 21,22. En effet, la microglie et les neurones interagissent dans diverses formes de communication bidirectionnelle 8,23 telles que les interactions directes médiées par les protéines membranaires ou les interactions indirectes par le biais de facteurs solubles ou de cellules intermédiaires23,24.
Par exemple, divers neurotransmetteurs sécrétés par les neurones peuvent moduler l’activité neuroprotectrice ou inflammatoire de la microglie 25,26,27. De plus, les interactions directes entre les neurones et la microglie aident à maintenir la microglie dans un état homéostatique28. À l’inverse, les interactions directes de la microglie avec les neurones peuvent façonner les circuits neuronaux29 et influencer la signalisation neuronale 30,31,32. Comme les perturbations de ces interactions induisent une hyperexcitabilité des neurones30 et une réactivité microgliale 33,34, des interactions microgliales-neuronales dérégulées sont impliquées comme un facteur contributif aux maladies neurologiques33,35. En effet, les maladies psychotiques23,26 et neurodégénératives ont été décrites comme présentant des interactions microgliales-neuronales dysfonctionnelles33. Bien que ces observations soulignent l’importance de la communication microgliale-neuronale dans le SNC, les mécanismes spécifiques de la façon dont ces interactions régulent les fonctions microgliales et neuronales dans la santé et la maladie sont relativement inconnus.
Dans un milieu complexe tel que le SNC, de multiples facteurs environnementaux peuvent influencer les interactions microgliales-neuronales, ce qui limite la capacité d’étudier les interactions cellulaires transitoires in vivo. Ici, nous présentons un système de co-culture microglie-neuronale in vitro qui peut être utilisé pour étudier les interactions cellulaires directes entre la microglie et les neurones. Ce protocole décrit la génération de microglie primaire et de neurones à partir des cortex de souris néonatales entre les jours postnatals 0 à 2 et les jours 16 à 18 des souris embryonnaires, respectivement. Les neurones et les microglies sont ensuite co-cultivés dans des plaques de 96 puits pour des expériences à haut débit en aval. Nous avons précédemment utilisé cette approche pour démontrer que la phagocytose microgliale protège les neurones de la mort cellulaire médiée par la phosphatidylcholine oxydée37, suggérant que cette méthode peut aider à comprendre les rôles de la microglie dans le contexte de la neurodégénérescence et de la SEP. De même, les co-cultures microgliales-neuronales peuvent également être utiles pour étudier l’impact de la diaphonie microgliale-neuronale dans d’autres contextes tels que les infections virales38 ou les lésions et réparations neuronales39. Dans l’ensemble, les systèmes de co-culture microglie-neuronale in vitro permettent aux chercheurs d’étudier les interactions microglie-neuronale dans un environnement manipulable et contrôlé, qui complète les modèles in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm Petri dish&#160;</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>07-202-011</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Versene</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Plus Neuronal Culture System&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>A3653401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 Medium (1x)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony stimulating factor&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11020-11</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH3023801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin Glutamine (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>103780-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S11008-42</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>08-916-5D</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-126-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flasks&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-680-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Codman</td>
			<td>30-4218</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S12052-10</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue&#160;</td>
			<td>Thermofisher Sci&#160;</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%)</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Immunofluorescence Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating and co-culturing murine primary microglia and cortical neurons

Les microglies sont des macrophages tissulaires du système nerveux central (SNC), remplissant de nombreuses fonctions qui soutiennent la santé neuronale et l’homéostasie du SNC. Il s’agit d’une population importante de cellules immunitaires associées à l’activité de la maladie du SNC, adoptant des phénotypes réactifs qui peuvent contribuer aux lésions neuronales lors de maladies neurodégénératives chroniques telles que la sclérose en plaques (SEP). Les mécanismes distincts par lesquels les microglies régulent la fonction neuronale et la survie au cours de la santé et de la maladie restent limités en raison des défis liés à la résolution des interactions complexes in vivo entre la microglie, les neurones et d’autres facteurs environnementaux du SNC. Ainsi, l’approche in vitro de la co-culture de la microglie et des neurones reste un outil précieux pour l’étude des interactions microglie-neurones. Ici, nous présentons un protocole pour générer et co-cultiver des microglies primaires et des neurones à partir de souris. Plus précisément, les microglies ont été isolées après 9 à 10 jours in vitro à partir d’une culture gliale mixte établie à partir d’homogénats cérébraux dérivés de souris néonatales entre les jours postnatals 0 et 2. Des cellules neuronales ont été isolées à partir de cortex cérébraux d’embryons de souris entre les jours embryonnaires 16 et 18. Après 4 à 5 jours in vitro, les cellules neuronales ont été ensemencées dans des plaques de 96 puits, suivies de l’ajout de microglie pour former la co-culture. Un timing minutieux est essentiel pour ce protocole, car les deux types de cellules doivent atteindre la maturité expérimentale pour établir la co-culture. Dans l’ensemble, cette co-culture peut être utile pour étudier les interactions microglie-neurone et peut fournir plusieurs lectures, y compris la microscopie d’immunofluorescence, l’imagerie en direct, ainsi que des dosages d’ARN et de protéines.

Microglia are tissue-resident macrophages that facilitate immunosurveillance and homeostasis in the central nervous system (CNS)1,2,3. They originate from yolk sac erythromyeloid progenitor cells that colonize the brain during embryonic development4,5,6&#160;and are maintained throughout the organism&#39;s life span through self-renewal, which involves proliferation and apoptosis7. At steady-state, resting microglia have ramified morphology and engage in tissue surveillance8,9,10.
Microglia express numerous cell-surface receptors, which enables them to rapidly respond to changes in the CNS11,12 and to promote inflammatory responses in the event of infections or tissue injury12,13,14, as well as during neurodegenerative diseases9,15, such as&#160;multiple sclerosis (MS)16,17. Microglia also express receptors to various neurotransmitters and neuropeptides18,19,20, which suggests they may also respond to and regulate neuronal activity21,22. Indeed, microglia and neurons interact in various forms of bidirectional communication8,23 such as direct interactions mediated by membrane proteins or indirect interactions through soluble factors or intermediate cells23,24.
For instance, various neurotransmitters secreted by neurons can modulate the neuroprotective or inflammatory activity of microglia25,26,27. Additionally, direct interactions between neurons and microglia help to maintain microglia in a homeostatic state28. Conversely, direct interactions of microglia with neurons can shape neuronal circuitry29 and influence neuronal signaling30,31,32. As disruptions of these interactions induce hyperexcitability of neurons30 and&#160;microglia reactivity33,34, dysregulated microglia-neuronal interactions&#160;are implicated&#160;as a contributing factor to&#160;neurological diseases33,35. Indeed, psychotic23,26 and neurodegenerative diseases have been described to exhibit dysfunctional microglia-neuronal interactions33. While these observations highlight the importance of microglia-neuronal communication in the CNS, specific mechanisms of how these interactions regulate microglial and neuronal functions in health and disease are relatively unknown.
Within a complex milieu such as the CNS, multiple environmental factors can influence microglia-neuronal interactions, which limits the ability to study transient cellular interactions in vivo. Here, we present an in vitro microglia-neuronal co-culture system that can be used to study direct cellular interactions between microglia and neurons. This protocol describes the generation of primary microglia and neurons from the cortices of neonatal mice between post-natal days 0-2 and embryonic mice days 16-18, respectively. Neurons and microglia are then co-cultured in 96-well plates for downstream high-throughput experiments. We previously used this approach to demonstrate that microglia phagocytosis protects neurons from oxidized phosphatidylcholine mediated cell death37, suggesting that this method can help to understand the roles of microglia in the context of neurodegeneration and MS. Similarly, microglia-neuronal co-cultures may also be useful for investigating the impact of microglia-neuronal crosstalk in other contexts such as viral infections38 or neuronal injury and repair39. Overall, in vitro microglia-neuronal co-culture systems&#160;enable researchers to study microglia-neuronal interactions in a manipulatable and controlled environment, which complements in vivo models.

Pleins feux sur l’auteur : Modèle de co-culture in vitro pour l’étude des interactions microglie-neuronale dans des conditions pathologiques

Génération et co-culture de microglie primaire murine et de neurones corticaux

La figure 1A montre un organigramme montrant les étapes clés de la culture mixte de cellules gliales pour les microglies. Dans l’ensemble, on s’attend à ce que des cellules clairsemées et un excès de débris cellulaires soient attendus au jour 1 (figure 1B). Au jour 4, une augmentation du nombre de cellules devrait être observée, en particulier avec la génération d’astrocytes adhérents, comme l’indique leur morphologie allongée (<strong class=...

Ce protocole décrit une co-culture microgliale-neuronale établie à partir de cellules neuronales primaires isolées d’embryons de souris aux jours embryonnaires 15-16 et de microglie primaire générée à partir du cerveau de souris néonatales aux jours postnatals 1er-2.

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS ...

generating-co-culturing-murine-primary-microglia-cortical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

839 vues.  University of Saskatchewan. Notre recherche vise à étudier les interactions entre les neurones et la microglie au cours de maladies telles que la sclérose en plaques. Notre objectif est de récapituler les interactions neuronales de la microglie in vitro afin de mieux comprendre leur importance fonctionnelle dans le SNC. Nous avons précédemment démontré que la phagocytose microgliale protège les neurones de la mort cellulaire médiée par la phosphatidylcholine oxydée avec cett...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Modèle de co-culture in vitro pour l’étude des interactions microglie-neuronale dans des conditions pathologiques

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS homeostasis. They are a major population of immune cells associated with CNS disease activity, adopting&#160;reactive phenotypes that potentially contribute to neuronal injury during chronic neurodegenerative diseases such as multiple sclerosis (MS). The distinct mechanisms by which microglia regulate neuronal function and survival during health and disease remain limited due to challenges in resolving the complex in vivo interactions between microglia, neurons, and other CNS environmental factors. Thus, the in vitro approach of co-culturing microglia and neurons remains a valuable tool for studying microglia-neuronal interactions. Here, we present a protocol to generate and co-culture primary microglia and neurons from mice. Specifically, microglia were isolated after 9-10 days in vitro from a mixed glia culture established from brain homogenates derived from neonatal mice between post-natal days 0-2. Neuronal cells were isolated from brain cortices of mouse embryos between embryonic days 16-18. After 4-5 days in vitro, neuronal cells were seeded in 96-well plates, followed by the addition of microglia to form the co-culture. Careful timing is critical for this protocol as both cell types need to reach experimental maturity to establish the co-culture. Overall, this co-culture can be useful for studying microglia-neuron interactions and can provide multiple readouts, including immunofluorescence microscopy, live imaging, as well as RNA and protein assays.

This protocol describes a microglia-neuronal co-culture established from primary neuronal cells isolated from mouse embryos at embryonic days 15-16 and primary microglia generated from the brains of neonatal mice at post-natal days 1-2.