我们提出了一种有价值的实验方法来研究灌注心脏中突然内在自主神经激活的动力学以及心脏儿茶酚胺能和胆碱能活性之间的相互作用。灌注小鼠心脏对环境变化非常敏感，例如温度、氧合和灌注液浓度。它们需要比大型动物模型更密切的监测。
此外，micro-LED 一开始可能需要进行一些反复试验才能获得一致的结果。我们正在努力了解当交感神经系统和副交感神经系统同时被激活时，心脏会发生什么。新的是，我们正在研究这个主题，使用光遗传学来光刺激心脏本身的心脏神经节和神经元。
这里显示的 micro-LED 成本低，并且相对易于复制。由于其尺寸，微型 LED 具有可作性，并且比较大的光源可以更精确地瞄准心脏区域。首先，在通风良好的区域，在解剖显微镜下，将两根绝缘铜线的剥皮端焊接到 465 纳米微型 LED 的接触点上。
将 micro-LED 连接到电源，然后打开它以测试焊接。将 200 微升过滤移液器吸头的底部切下一厘米。使用小直径杆推出过滤器。
将带有连接电线的 micro-LED 插入移液器吸头，使 LED 与吸头末端齐平。更换移液器吸头顶部的过滤器，以固定 LED 指示灯和导线。然后将 LED 的边缘强力胶粘到移液器吸头上。
让强力胶干燥。要制备有机硅弹性体，请将基料和固化剂混合，直到溶液变得均匀。使用真空室去除混合物中的任何气泡。
接下来，取 0.5 毫升离心管并在侧面划痕，以便于 LED 去除。用胶带粘住离心管的外部以防止泄漏。将大约 0.2 毫升的有机硅弹性体倒入试管中。
将 micro-LED 移液器吸头放入试管中，确保 LED 和试管底部之间至少留出 1 毫米的间隙。将离心管 micro-LED 直立置于 50 摄氏度的烤箱中 8 小时或过夜。弹性体硬化后，从管中取出 LED。
固化后，用精密美工刀修剪 LED 尖端上多余的弹性体，留下不超过 1 毫米的厚度。首先，将 175 毫升 Krebs-Henseleit 或 KH 溶液添加到灌注系统中。在 Langendorff 灌注系统中放置一个 10 微米的膜过滤器。
然后开始循环。打开水浴并将它们设置为将灌注液温度保持在 37 摄氏度。要校准流量计，请使用旋塞阀停止灌注系统中的流量。
然后按量计上的归零按钮进行校准。打开 LabChart 数据采集软件。将软件配置为包括 12 个通道。
设置心浴温度、主动脉灌注液温度、ECG 导联 1 到 3 的通道（用于额外的计算导联）、心率计算、流速和函数发生器输出以跟踪 LED 脉冲。接下来，使用为心率指定的频道来计算心率。激活循环测量功能，将其设置为检测导联 1 上的小鼠心电图。
使用 LabChart 的心脏通路扩展，根据导联 1 和 2 计算导联 3 个 aVR、aVL 和 aVF。对小鼠进行麻醉和安乐死后，用一把镊子握住剑突，用手术剪刀切入腹腔。小心切开隔膜以打开胸腔。
然后切开肋骨，露出心脏和肺。轻轻抓住肺部，切除心脏和肺部。将心脏放入含有肝素化 KH 溶液的培养皿中。
去除肺部和任何大的脂肪沉积物。在解剖显微镜下，设置为 2 倍放大倍率。将清洁后的心脏转移到第二皿肝素化 KH 溶液中。
找到主动脉并使用细镊将其滑过套管。用 4-0 丝缝合线将心脏固定在套管上。接下来，用一团肝素化 KH 冲洗套管，以去除冠状动脉血管中的血液。
将空心连接到灌注系统，并将其放入装满灌注液的 PDMS 培养皿中。根据 Einthoven 三角形将 ECG 针电极放入 PDMS 培养皿中。旋转心脏，以便可以接触到左心房。
使用微型自开式剪刀在左心房切开一个 1 毫米的切口。将一根直径为 1 毫米的管子插入切口，让左心室中截留的灌注液引流。接下来，旋转心脏，使右心房朝上，并且窦房结可以进入以进行照明。
根据需要调整心电图电极，将其移近心脏以提高信噪比。对于光遗传学激活，将 micro-LED 器件连接到函数发生器，并将其配置为产生频率为 10 赫兹、脉冲宽度为 30 毫秒、峰峰值幅度为 10 伏的脉冲波。将 micro-LED 轻轻放在窦房结上。
然后打开函数发生器，观察光刺激引起的心率变化。心率的即时变化表明有效激活。关闭函数生成器。
让心率恢复到激活前的水平。如果光遗传学激活导致心率变化小于 100 BPM，请重新定位 micro-LED 以照亮右心房中的神经元。ChAT 神经元的光遗传学刺激在光刺激期间使心率降低了 100 BPM 以上，而去甲肾上腺素在整个刺激过程中没有维持降低。
服用 2， 000 纳摩尔去甲肾上腺素后，心率下降了 40 BPM，并在关灯前开始恢复。通过 ChAT 神经元光刺激对心率的光遗传学抑制在克服高去甲肾上腺素剂量诱导的心率增加方面效果较差，导致抑制时间更短，心率下降幅度更小。
