我们的研究重点是催化活性 RNA 的动力学以及这些动力学在不同环境条件下如何变化。我们使用单分子 FRET 来研究单价和二价中线、伴侣蛋白和拥挤剂等因素对 RNA 动力学的影响。在不破坏 RNA 结构和功能的情况下精确掺入供体和受体荧光团具有挑战性。
此外，追踪大动态 RNA 的折叠也很困难。然而，已建立的标记和封装方案使我们能够监测功能性 RNA 随时间推移的折叠动力学。我们的方案解决了在新生理条件下实时观察大的、具有催化活性的 RNA 的挑战。
通过共价标记和封装 RNA 和囊泡，然后将其表面固定，我们可以使用单分子 TIRF 监测 RNA 功能。我们专注于长催化 RNA 的共价 FRET 标记，尤其是 II 组内含子。由于它们的结构复杂性，这是一个挑战。
当封装在囊泡中时，我们可以将 RNA 保持在 TIRF 显微镜的消逝场内，但 RNA 可以自由漂浮。通过这种方式，smFRET 可以毫无阻碍地揭示 RNA 的动态行为。我们将继续尝试了解自然界的真正运作方式，使用多技术方法专注于核糖体、核糖开关和其他调节 RNA 的结构-功能关系和动力学。
因此，在生理和细胞条件下进行研究将成为我们未来工作的主要重点。首先，将目标 RNA 分装，每管加入 55 μL 双蒸水中，加入 50 至 75 μg RNA，然后向 RNA 中加入 45 μL EDC/NHS 乙酸钠 pH 6 混合物。将混合物在 25 摄氏度下孵育 4 小时，同时以 500 RPM 的速度摇动。
孵育后，将活化的 RNA 沉淀重悬于 95 μL 100 毫摩尔 MOPS 缓冲液 pH 7.5 中。然后向活化的 RNA 中加入 5 微升 2 毫摩尔磺化花青-3 胺，并在 25 摄氏度下以 500 RPM 孵育 16 小时，以将荧光团偶联到活化的 5-引物磷酸盐上。第二天，加入 200 微升双蒸水以改善分离。
然后通过乙醇沉淀纯化 5-prime 磷酸盐标记的 RNA。纯化后，将标记的 RNA 重悬于 100 μL 100 毫摩尔 tris HCl 中，并在 25 摄氏度下孵育 2 小时。然后，为了去除游离染料，用离心过滤的双蒸水洗涤标记的 RNA。
对于双末端标记，将 5 个引物末端标记的 RNA 分装，每管在 90 μL 溶液中含有大约 50 至 75 μg RNA。加入 5 微升 pH 值为 5.5 的 1 摩尔乙酸钠缓冲液。然后加入 4 微升新鲜制备的 500 毫摩尔偏高碘酸钠储备液。
对于 3-prime 末端单标记，加入 8 微升偏高碘酸盐原液。将溶液在黑暗中孵育 2 小时后，吸取 30 微升 50% 甘油以终止反应。孵育 30 分钟后，加入 400 微升冰冷的乙醇乙酸钠沉淀混合物。
将氧化的 RNA 沉淀重悬于 95 μL 的 50 毫摩尔乙酸钠缓冲液中，pH 值为 6。如前所述，通过乙醇沉淀和离心过滤纯化双端标记的 RNA。在双蒸水中洗脱纯化的 RNA。
目视比较每个步骤后获得的上清液和沉淀颜色。在 UV-可见分光光度计上计算 RNA 和偶联染料浓度。荧光凝胶电泳证实了 RNA 的成功单和双标记，如 RNA 与荧光团的共迁移所示。
在金属离子存在下，FRET 效率增加，表明 RNA 折叠，这导致供体发射减少，受体发射增加。要准备微流体室，请使用金刚石钻机在石英载玻片上钻四个孔以形成两个通道。将钻孔的石英载玻片和大约两倍数量的盖玻片放入带盖的玻璃 Coplin 染色罐中。
在双蒸水中对玻片和盖玻片进行超声处理 5 分钟。接下来，在 50 摄氏度下，在 10% 实验室玻璃器皿清洁溶液中对染色缸进行超声处理 30 分钟。用双蒸水冲洗罐子后，在一摩尔氢氧化钾溶液中超声处理 30 分钟，然后在溶液中放置过夜。
用蒸馏水反复冲洗和超声处理后，使用氮气流干燥载玻片和盖玻片。用氧气等离子清洗剂处理干燥的玻片和盖玻片 30 分钟。将干净的玻片和盖玻片放入含有 3% AP 测试乙醇溶液的 Coplin 染色瓶中超声处理 1 分钟，然后孵育 30 分钟。
用无水乙醇和双蒸水冲洗载玻片和盖玻片各 3 次，然后在氮气流下干燥。接下来，将空的移液管吸头盒中装满双蒸水，准备一个潮湿的盒子。将玻片放入盒子内，待处理的一面朝上。
将 30 微升新鲜制备的 bPEG/mPEG 混合物液滴添加到载玻片中心以覆盖两个通道。用干净的盖玻片盖住液滴并关闭潮湿箱。将盒子在黑暗中孵育过夜以进行聚乙二醇化。
第二天，用双蒸水冲洗 PEG 钝化和生物素化的载玻片和盖玻片，并观察处理过的表面的疏水性变化。将双面贴纸贴在载玻片上，确保贴纸覆盖感兴趣的区域。然后小心地将盖玻片放在载玻片的顶部，使聚乙二醇化表面彼此相对。
将组装好的腔室转移到 50 毫升离心管中，并向管中填充氮气。首先，使用无菌针头在无菌干净的 2 毫升试管的盖子上从内到外戳一个孔。将 109 微升 bPE-DMPC 混合物加入试管中。
将微管储存盒中的纸板细胞隔板插件放入 500 毫升 Schlenk 烧瓶中，用作试管架。使用长镊子，小心地将含有脂质混合物的试管放入试管架中。在低流量的氮气下蒸发氯仿过夜。
获得干燥的脂质层后，用封口膜密封试管以覆盖孔。使用 100 纳米聚碳酸酯膜和 10 毫米聚酯排水盘组装挤出机。用防眨眼缓冲液平衡注射器和膜。
将双端标记的 RNA 与抗闪烁缓冲液混合后，在 30 摄氏度下用 RNA 抗闪烁缓冲液混合物水合脂质饼。以 1， 400 RPM 的速度摇晃 5 分钟，然后以 700 RPM 的速度摇晃 15 分钟。以 13， 000 G 的离心力将混合物离心 2 分钟，并用 250 μL 抗闪烁缓冲液稀释上清液。
用 RNA 脂质悬浮液填充注射器，并在 30 摄氏度下在加热块上挤出 35 次，以将双端标记的 RNA 封装在直径为 100 纳米的磷脂囊泡中。在室温下用 200 μL 5X 标准缓冲液冲洗腔室 2 次。用 50 微升或每毫升 20 微升的链霉亲和素溶液填充腔室，并孵育 5 分钟。
然后用 200 微升标准缓冲液和 100 微升防闪烁缓冲液冲洗腔室。加入 75 μL 囊泡悬液并孵育 10 分钟，以将包封的 RNA 固定在表面。固定后，用 200 微升新鲜制备的成像缓冲液冲洗腔室。
对于数据采集，将腔室安装在 TIRF 显微镜上，并使用交替激光激发采集 smFRET 数据。使用 TIRF 显微镜的单分子 FRET 成像可跟踪单个 RNA 分子并检测 FRET 效率的实时变化。动态单分子迹线显示供体和受体信号之间的反相关波动，表明 RNA 的确认变化。
