3D单分子跟踪可以确定单个蛋白质的亚细胞定位和运动行为。观察活细胞中的蛋白质运动，可以提供有关蛋白质与原生环境中结合伙伴相互作用的重要见解。本文介绍的方法为分析单分子跟踪数据以解决生物分子扩散状态提供了一个通用框架。
它可以应用于两个 2D 和 3D 轨迹，这些轨迹仅限于任意形状的单元格体积。将荧光珠沉积在随附的文本协议中描述的预先准备好的 agarose 垫中后，将其放在显微镜盖滑上，然后将盖滑固定到显微镜样品支架上。然后将样品支架安装在倒置荧光显微镜上。
然后初始化显微镜的图形用户界面;在这里，MATLAB中定制编写的软件用于仪器控制。初始化相机软件HCImage实时。在"摄像机控制"部分下的"捕获"选项卡中，将曝光时间设置为 0.03 秒，然后单击"实时"以开始摄像机的实时馈送。
单击 GUI 界面上相应的"打开激光"按钮以解除阻止激光并激发 agarose 垫上的荧光珠。使用实时流模式查看摄像机上的荧光发射。通过单击用户界面的微定位阶段部分下的 XY 位置箭头，在视野中心放置至少一个荧光珠，调整显微镜阶段的 X 和 Y 位置。
如有必要，通过单击箭头下方的下拉框来更改步进大小。接下来，单击"纳米定位阶段"部分下的 Z 位置箭头，调整显微镜阶段的 Z 位置。将荧光珠的双螺旋点扩散功能的方向设置为垂直。
此垂直方向定义为 Z 校准的起点。以 50 纳米的增量扫描起动 Z 位置上方和下方的 30 步。使用 0.03 秒的曝光时间在每个步骤中记录 10 帧。
要开始自动数据采集，请单击"在 Z 校准下转到"。在室温下以5000倍重力将一毫升热震的Yersinia肠糖培养物离心3分钟，然后去除培养物并丢弃上清液。用一毫升的M2G介质清洗颗粒三次。
最后冲洗后，在 M2G 介质的 250 微升中重新暂停颗粒细菌。接下来添加荧光珠用作基准标记。应添加荧光珠溶液，以便在显微镜中观察时，每个视野只有一到两个珠子。
通过涡旋轻轻混合悬浮液，将悬浮液的任何聚集细胞和悬浮液的1.5微升板分离到用M2G制造的1.5至2%的气糖垫上，然后反转垫，并放在臭氧清洁的显微镜盖上。将一滴浸入油添加到显微镜目标上，并将样品支架放在显微镜舞台上并固定到位。初始化图形用户界面以控制显微镜的相机、采样阶段和激励激光器，然后初始化相机软件。
在"摄像机控制"部分下的"捕获"选项卡中，将曝光时间设置为 0.025 秒，然后单击"实时"以开始摄像机的实时馈送。通过单击微定位阶段部分下的 XY 位置箭头来调整显微镜阶段的 X 和 Y 位置，以扫描样品周围并找到具有适当密集细菌细胞群的视场。为了最大限度地提高数据吞吐量，盖滑单上的单元密度应尽可能高，不会使单元格重叠或相互接触。
视野还应至少包括一个荧光珠作为基准标记，以便可以在获取数据时测量阶段移位。接下来，通过单击纳米定位阶段部分下的 Z 位置箭头来调整显微镜阶段的 Z 位置，使荧光珠的双螺旋点扩散功能叶垂直。然后转到"序列"并选择"扫描设置"。
将帧数数更改为 20，000。接下来，单击标有三个点的按钮，选择保存目标文件夹。最后，单击"开始"以收集多达 20，000 个摄像机帧，使用 0.025 秒的短暂曝光时间。
完成后，单击图形用户界面中相应的"关闭激光"按钮来阻止激光照明。然后使用相同的曝光时间收集 200 帧的深色图像。选中 Thorlabs LED 旁边的框，然后单击"向上切换镜像"。这将打开试样上方的 LED 指示灯，并将显微镜从荧光通路切换到相位对比通路。
在相位对比度路径上初始化数据采集软件，然后按"开始/停止实时显示"按钮查看来自摄像机的实时源。然后单击"捕获"和"转到"以保存图像，以收集当前视野中单元格的相位对比度图像。将荧光珠安装以用作基准标记。
使用文本协议中描述的模板阈值查找并适合所有本地化和所有摄像机帧。在 Easy-DHPSF GUI 的本地化 DHPSF SM 部分下，单击"运行"以适合单分子信号，然后单击以下弹出窗口上的"确定"以保留默认设置。该软件将发现单分子荧光信号，类似于双螺旋点传播功能，然后尝试使用双高斯模型来拟合它们。
当脚本运行时，用户将看到原始图像数据的显示以及成功安装的单分子信号的重建图像。使用 MATLAB 中的自定义编写软件，首先在弹出窗口中手动选择五个控制点对，通过粗略估计和单击单分子定位数据和细胞轮廓中相同五个单元的细胞极。删除包含少于 10 个定位的单元格，并删除部分位于视图范围外的单元格，然后通过单击其单元格轮廓内部删除弹出窗口中任何其他不需要的单元格。
最后，将驻留在单元格轮廓边界内的本地化分配给该单元格。放弃任何不在任何单元格轮廓内的本地化。成功应用本协议的一个关键因素是确保单分子信号彼此分离良好。
如果一个细胞中同时有多个荧光分子，那么定位可以错误地分配给另一个分子的轨迹。该协议通过丢弃同一单元中同时存在两个或多个本地化的任何轨迹来消除链接问题。因此，如果单分子信号过于密集，在处理过程中会自动丢弃大量这些数据。
根据荧光标记的融合蛋白的表达水平，每个细胞可生成大约200至3000个定位。这些定位可以产生 10 到 150 个轨迹。要产生样本良好的分布，需要大量的轨迹。
这里展示的是Yersinia肠糖分泌蛋白YSCQ近8万个单分子轨迹的表观扩散系数的直方图，该分布图标有荧光蛋白eYFP。YscQ 与膜嵌入的注入体结合，产生一小部分分子，大约 24% 不扩散，如黑色所示的分布所示。剩余的YscQ分子在细胞胶中自由扩散。
在本文所述方法中，确定未绑定的YscQ分子存在至少三种不同的扩散状态。通过将表观扩散系数的分布与已知扩散系数的模拟分布库进行拟合，得出了这一结论。在试图解决多个扩散状态时，应收集几千个单分子轨迹，以确保对明显的扩散系数分布进行很好采样。
单分子跟踪可以在野生细胞或遗传缺失突变体中进行，以确定特定扩散状态是否仅在存在分子结合伙伴时显现出来。通过利用3D单分子跟踪解决细胞蛋白和蛋白质复合物的扩散状态，研究人员可以确定在活细胞中，寡聚蛋白复合物在何时、何时以及如何形成。使用大功率激光源和活的人类病原体可能极其危险。
应始终遵循适当的激光安全和生物安全协议。
