通过膜片钳技术记录新鲜分离的基底动脉平滑肌细胞中的向内整流 K ⁺ 电流

我的研究主要集中在心脑血管电生理学。本研究描述了一种分离原代血管肌细胞并利用全细胞捏夹技术来辅助其电生理特性的方法。新鲜细胞分离具有局限性，例如温度对酶分离的影响、不同血管的不同消化时间以及在细胞天然环境中的即时能力。

此外，夹管夹技术对天花板和膜破裂提出了挑战，需要熟练的作。该协议设施研究很容易从手动动脉获取活性原代细胞，并且必须迅速实施捏夹技术的应用。首先，在培养皿中加入 95% 氧气和 5% 二氧化碳饱和的冷生理盐水溶液。

将分离的大鼠大脑放入培养皿中。将大脑腹侧向上放置在培养皿中，并用针头固定。在光学显微镜下，找到基底动脉。

用高压灭菌器、镊子和剪刀小心地去除周围的组织。接下来，将一根直径为 25 微米的 2 厘米长的导线插入离体的基底动脉。用铁丝轻轻摩擦动脉内壁，以有效去除血管内皮。

要分离平滑肌细胞，首先，将试管 1 至 3 中的溶液预热。将分离的基底动脉转移到试管 2 中。将混合物在 37 摄氏度下孵育 30 分钟，同时将 95% 氧气和 5% 二氧化碳的混合物连续注入试管中。

接下来，将基底动脉从 2 号试管转移到 3 号试管并孵育。将 1 毫升预热的细胞分离溶液从试管 1 转移到试管 3 中。继续注入 95% 氧气和 5% 二氧化碳，同时保持酶处理 3 分钟。

研磨基底动脉制剂以释放细胞。接下来，将 4 毫升冷分离溶液移液到试管 3 中，以终止酶促过程。将混合物以 59 G 离心 6 分钟。

用移液管弃去上清液。然后再次加入冷分离液。最后一次洗涤后，去除上清液。

留下 1 毫升细胞悬液。将细胞悬液在 4 摄氏度下储存 6 到 8 小时。将 100 μL 细胞悬液转移到浴中。

在浴中加入 1 毫升细胞外液，静置。首先，打开微量移液器。将玻璃管放入极轴中。

在控制面板上，选择程序 1。点击 enter 并访问程序 1。现在通过单击控制面板上的 ramp 来执行 ramp 测试，以测量玻璃管的热值。

插入新的玻璃管。然后选择程序一，然后单击 enter 以制造微量移液器。要记录护理电流，首先启动数据采集软件。

选择 file，然后单击 set data file names 以建立数据存储路径。在工具菜单中启用膜测试功能。将大鼠基底动脉分离的平滑肌细胞样本放在显微镜相机视图的中心。

将参比丝尖端浸入浴液中。然后用细胞内溶液填充 20% 的制备的微量移液器。将加载的微量移液器固定在记录电极支架上。

现在用注射器施加正压。将移液器吸头移入浴液中，并在信号放大器软件上调整移液器偏移量，将当前基线设置为零皮安。轻轻地将移液器压在细胞膜上。

观察到对至少一个 magome 的密封阻力增加。去除正压并施加负压。为了建立高电阻，密封电阻至少为 1 千兆伏，将保持电压设置为负 60 毫伏，并使用 CP FAST 和 CP slow 补偿电极电容。

施加短暂的负压以破坏细胞膜，形成整个细胞构型。在信号放大器软件中选择整个单元。然后单击 auto 进行膜电容补偿。

加载 kir 协议并开始数据记录。分离出新鲜分离的具有纺锤形形态的平滑肌细胞。细胞健康，适合膜片钳实验。

典型的固化电流在负电压下表现出向内整流，在正电压下钾离子电流最小或没有。浓度为 100 至 300 μmol/L 的氯化钡可有效抑制 kir 通道活性，确认电流为 kir。硝普钠增加 Kir 电流，表明 kir 通道在 SNP 诱导的血管舒张中的作用。

电流电压关系的比较表明，在氯化钡存在下电流密度降低，而在 SNP 存在下电流密度增加。