제 연구는 주로 심뇌혈관 전기생리학에 중점을 두고 있습니다. 이 연구는 원발성 혈관 근육 세포를 분리하고 전체 세포 핀치 클램프 기술을 활용하여 전기 생리학적 특성을 지원하는 방법을 설명합니다. 신선한 세포 분리는 효소 분리에 대한 온도의 영향, 다른 혈관에 대한 다양한 소화 시간, 세포 고유 환경에서의 즉각적인 능력과 같은 한계가 있습니다.
또한 핀치 클램프 기술은 숙련된 작동이 필요한 천장 및 멤브레인 파열에 대한 문제를 제시합니다. 이 프로토콜 시설 연구는 수동 동맥에서 활성 일차 세포를 쉽게 획득하는 데 있으며 핀치 클램프 기술의 적용을 신속하게 적용해야 합니다. 시작하려면 페트리 접시에 산소 95%와 이산화탄소 5%로 포화된 차가운 생리식염수를 채웁니다.
고립된 쥐의 뇌를 페트리 접시에 넣는다. 페트리 접시에 뇌를 복부 위쪽으로 놓고 바늘로 고정합니다. 광학 현미경으로 기저 동맥을 찾습니다.
오토클레이브, 핀셋 및 가위를 사용하여 주변 조직을 조심스럽게 제거합니다. 다음으로, 직경 25마이크로미터의 2cm 길이의 와이어를 고립된 기저 동맥에 삽입합니다. 동맥 내벽을 와이어로 부드럽게 문지르면 혈관 내피를 효과적으로 제거할 수 있습니다.
평활근 세포를 분리하려면 먼저 시험관의 용액을 1-3으로 예열합니다. 분리된 기저 동맥을 시험관 2로 이식합니다. 섭씨 37도에서 30분 동안 혼합물을 배양하면서 95%의 산소와 5%의 이산화탄소 혼합물을 튜브에 지속적으로 주입합니다.
다음으로, 기저동맥을 2번 시험관에서 3번 시험관으로 옮기고 배양합니다. 예열된 세포 분리 용액 1ml를 1번 시험관에서 3번 시험관으로 옮깁니다. 95%의 산소와 5%의 이산화탄소를 계속 주입하면서 3분 동안 효소 처리를 유지합니다.
세포를 방출하기 위해 기저동맥 제제를 분쇄합니다. 다음으로 4 밀리리터의 냉간 분리 용액을 시험관 3 개에 피펫팅하여 효소 과정을 종료합니다. 혼합물을 59G에서 6분 동안 원심분리합니다.
피펫을 사용하여 상층액을 버립니다. 그런 다음 냉간 분리 용액을 다시 추가하십시오. 마지막 세척 후 상층액을 제거하십시오.
1ml의 세포 현탁액을 남겨 둡니다. 세포 현탁액을 섭씨 4도에서 6-8시간 동안 보관하십시오. 100 마이크로 리터의 세포 현탁액을 수조로 옮깁니다.
1ml의 세포외액을 욕조에 넣고 휴식을 취하십시오. 시작하려면 마이크로피펫 극성을 켭니다. 극지방에 유리관을 놓습니다.
제어판에서 프로그램 1을 선택합니다. Enter를 클릭하고 프로그램 1에 액세스합니다. 이제 제어판에서 램프를 클릭하여 램프 테스트를 수행하여 유리관의 열 값을 측정합니다.
새 유리관을 삽입합니다. 그런 다음 프로그램 1을 선택하고 Enter를 클릭하여 마이크로 피펫을 제작합니다. 현재 관리 상태를 기록하려면 먼저 데이터 수집 소프트웨어를 실행하십시오.
파일을 선택한 다음 데이터 파일 이름 설정을 클릭하여 데이터 저장 경로를 설정합니다. 도구 메뉴에서 멤브레인 테스트 기능을 활성화합니다. 쥐의 기저 동맥에서 분리된 평활근 세포 샘플을 현미경의 카메라 뷰 중앙에 놓습니다.
기준 와이어 팁을 수조 용액에 담그십시오. 그런 다음 제작된 마이크로 피펫의 20%를 세포 내 용액으로 채웁니다. 적재된 마이크로 피펫을 기록 전극 홀더에 고정합니다.
이제 주사기로 양압을 가하십시오. 피펫 팁을 수조 용액으로 옮기고 신호 증폭기 소프트웨어에서 피펫 오프셋을 조정하여 현재 기준선을 0 피코암페어로 설정합니다. 피펫을 세포막에 부드럽게 누릅니다.
적어도 하나의 마고메에 대한 밀봉 저항의 증가를 관찰하십시오. 양압을 제거하고 음압을 가하십시오. 적어도 하나의 giggome의 밀봉 저항으로 높은 저항을 설정하려면 유지 전압을 마이너스 60밀리볼트로 설정하고 CP FAST 및 CP slow를 사용하여 전극 커패시턴스를 보상합니다.
짧은 음압을 가하여 세포막을 파열시켜 전체 세포 구성을 형성합니다. 신호 증폭기 소프트웨어에서 전체 셀을 선택합니다. 그런 다음 멤브레인 커패시턴스 보상을 위해 자동을 클릭합니다.
kir 프로토콜을 로드하고 데이터 기록을 시작합니다. 방추체 형태를 가진 갓 분리된 평활근 세포를 분리했습니다. 세포는 건강하고 패치 클램프 실험에 적합했습니다.
일반적인 경화 전류는 음의 전압에서 내부 정류를 나타내며 양의 전압에서 칼륨 이온 전류 흐름이 최소화되거나 전혀 표시되지 않았습니다. 리터당 100-300 마이크로 몰의 농도에서 염화 바륨은 kir 채널 활성을 효과적으로 억제하여 전류를 kir로 확인했습니다. 나트륨 니트로프러스사이드는 SNP 유도 혈관 확장에서 kir 채널의 역할을 나타내는 kir 전류를 증가시켰습니다.
전류 전압 관계를 비교한 결과, 염화바륨이 있을 때 전류 밀도가 감소하고 SNP가 증가한 것으로 나타났습니다.
