Araştırmam ağırlıklı olarak kardiyovasküler serebrovasküler elektrofizyoloji üzerine odaklanmaktadır. Bu çalışma, birincil vasküler kas hücrelerini izole etmek ve elektrofizyolojik özelliklerine yardımcı olmak için tam hücre kıskaç kelepçesi teknolojisini kullanmak için bir yöntemi açıklamaktadır. Taze hücre izolasyonu, sıcaklığın enzim ayrımı üzerindeki etkisi, farklı kan damarları için değişen sindirim süreleri ve hücrelerin doğal ortamında anlık yetenek gibi sınırlamalara sahiptir.
Ek olarak, sıkıştırma kelepçesi teknolojisi, ustaca çalışma gerektiren tavan ve membran yırtılmasında zorluklar sunar. Bu protokol tesisleri araştırması, manuel arterlerden aktif primer hücrelerin kolayca elde edilmesidir ve hızlı bir şekilde kıstırma kelepçesi tekniğinin uygulanmasını sağlamalıdır. Başlamak için, bir Petri kabını% 95 oksijen ve% 5 karbondioksit ile doyurulmuş soğuk fizyolojik tuzlu su çözeltisi ile doldurun.
İzole edilmiş bir sıçan beynini Petri kabına yerleştirin. Beyni Petri kabında ventral olarak yukarı doğru konumlandırın ve iğnelerle sabitleyin. Işık mikroskobu altında baziler arteri bulun.
Otoklav, cımbız ve makasla çevredeki dokuyu dikkatlice çıkarın. Daha sonra, izole edilmiş baziler artere 25 mikrometre çapında iki santimetre uzunluğunda bir tel yerleştirin. Vasküler endotelyumu etkili bir şekilde çıkarmak için arterin iç duvarını tel ile hafifçe ovalayın.
Düz kas hücrelerini izole etmek için, önce test tüplerindeki çözeltileri bir ila üç arasında önceden ısıtın. İzole edilmiş baziler arteri ikinci test tüpüne aktarın. Karışımı 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe ederken, tüpe sürekli olarak% 95 oksijen ve% 5 karbondioksit karışımı enjekte edin.
Daha sonra, baziler arteri test tüpü ikiden test tüpü üçe aktarın ve inkübe edin. Bir mililitre önceden ısıtılmış hücre ayırma solüsyonunu test tüpü bir'den test tüpü üçüne aktarın. Enzimatik tedaviyi üç dakika sürdürürken %95 oksijen ve %5 karbondioksit enjekte etmeye devam edin.
Hücreleri serbest bırakmak için baziler arter preparatını tritüre edin. Ardından, enzimatik işlemi sonlandırmak için üçüncü tüpü test etmek için dört mililitre soğuk ayırma solüsyonu pipetleyin. Karışımı 59 G'de altı dakika santrifüjleyin.
Bir pipetle süpernatanı atın. Ardından tekrar soğuk ayırma solüsyonu ekleyin. Son yıkamadan sonra süpernatanı çıkarın.
Hücre süspansiyonunun bir mililitresini bırakın. Hücre süspansiyonunu altı ila sekiz saat boyunca dört santigrat derecede saklayın. 100 mikrolitre hücre süspansiyonunu bir banyoya aktarın.
Banyoya bir mililitre hücre dışı sıvı ekleyin ve dinlenmeye bırakın. Başlamak için bir mikropipet polarını açın. Kutuplara bir cam tüp yerleştirin.
Kontrol panelinde birinci programı seçin. Enter'a tıklayın ve birinci programa erişin. Şimdi cam tüpün ısı değerini ölçmek için kontrol panelindeki rampaya tıklayarak bir rampa testi yapın.
Yeni bir cam tüp yerleştirin. Ardından birinci programı seçin ve mikro pipeti üretmek için enter'a tıklayın. Bakım akımını kaydetmek için önce veri toplama yazılımını başlatın.
Dosyayı seçin, ardından bir veri depolama yolu oluşturmak için veri dosyası adlarını ayarla'ya tıklayın. Araçlar menüsünde membran testi işlevini etkinleştirin. Bir sıçanın baziler arterinden izole edilmiş düz kas hücrelerinin bir örneğini mikroskobun kamera görüntüsünün ortasına yerleştirin.
Referans tel ucunu banyo solüsyonuna daldırın. Daha sonra üretilen mikro pipetin %20'sini hücre içi solüsyonla doldurun. Yüklenen mikro pipeti kayıt elektrot tutucusuna sabitleyin.
Şimdi bir şırınga ile pozitif basınç uygulayın. Pipet ucunu banyo solüsyonuna taşıyın ve mevcut taban çizgisini sıfır pikoampere ayarlamak için sinyal amplifikatör yazılımındaki pipet ofsetini ayarlayın. Pipeti hücre zarına hafifçe bastırın.
En az bir magoma karşı conta direncinde bir artış gözlemleyin. Pozitif basıncı kaldırın ve negatif basınç uygulayın. En az bir giggome sızdırmazlık direnci ile yüksek direnç oluşturmak için, tutma voltajını eksi 60 milivolta ayarlayın ve CP FAST ve CP slow kullanarak elektrot kapasitansını telafi edin.
Hücre zarını yırtmak için kısa bir negatif basınç uygulayın ve bütün bir hücre konfigürasyonu oluşturun. Sinyal amplifikatör yazılımında tüm hücreyi seçin. Ardından membran kapasitans telafisi için otomatik'e tıklayın.
Kir protokolünü yükleyin ve veri kaydına başlayın. İğsi morfolojisine sahip taze izole edilmiş düz kas hücreleri izole edildi. Hücreler sağlıklıydı ve yama kelepçesi deneyleri için uygundu.
Tipik bir kür akımı, pozitif voltajlarda minimum veya hiç potasyum iyon akımı akışı olmadan negatif voltajlarda içe doğru düzeltme sergiledi. Litre başına 100 ila 300 mikromol konsantrasyonlarındaki baryum klorür, akımı kir olarak doğrulayarak kir kanalı aktivitesini etkili bir şekilde inhibe etti. Sodyum nitroprussid, SNP'nin neden olduğu vazodilatasyonda kir kanallarının rolünü gösteren kir akımını artırdı.
Akım voltajı ilişkilerinin karşılaştırılması, baryum klorür varlığında akım yoğunluğunda bir azalma ve SNP ile bir artış gösterdi.
