המחקר שלי מתמקד בעיקר באלקטרופיזיולוגיה של כלי דם במוח. מחקר זה מתאר שיטה לבידוד תאי שריר כלי דם ראשוניים ושימוש בטכנולוגיית מהדק צביטה של תאים שלמים כדי לסייע בתכונותיהם האלקטרופיזיולוגיות. לבידוד תאים טריים יש מגבלות כגון השפעת הטמפרטורה על הפרדת האנזימים, זמני עיכול משתנים לכלי דם שונים ויכולת מיידית בסביבה הטבעית של התאים.
בנוסף, טכנולוגיית מהדק צביטה מציבה אתגרים בקרע בתקרה ובממברנה הדורש הפעלה מיומנת. מחקר מתקני פרוטוקול זה הוא ברכישת תאים ראשוניים פעילים בקלות מעורקים ידניים וחייב לצלצל במהירות ליישום טכניקת מהדק הצביטה. כדי להתחיל, מלאו צלחת פטרי בתמיסת מלח פיזיולוגית קרה רוויה ב-95% חמצן ו-5% פחמן דו חמצני.
הניחו מוח עכברוש מבודד בצלחת הפטרי. מקם את המוח עם הגחון כלפי מעלה בצלחת הפטרי ואבטח אותו עם מחטים. תחת מיקרוסקופ אור, אתר את העורק הבסיסי.
בעזרת חיטוי, פינצטה ומספריים, הסר בזהירות את הרקמה שמסביב. לאחר מכן, הכנס חוט באורך שני סנטימטרים בקוטר 25 מיקרומטר לעורק הבסיסי המבודד. שפשפו בעדינות את הדופן הפנימית של העורק עם החוט כדי להסיר ביעילות את האנדותל של כלי הדם.
כדי לבודד תאי שריר חלק, ראשית, יש לחמם מראש את התמיסות במבחנות אחת עד שלוש. העבירו את העורק הבסיסי המבודד למבחנה שתיים. דגרו את התערובת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות תוך הזרקה רציפה של תערובת של 95% חמצן ו-5% פחמן דו חמצני לתוך הצינור.
לאחר מכן, העבירו את העורק הבסיסי ממבחנה שתיים למבחנה שלוש ודגרו. העבירו מיליליטר אחד של תמיסת הפרדת תאים שחוממה מראש ממבחנה אחת למבחנה שלוש. המשך הזרקת 95% חמצן ו-5% פחמן דו חמצני תוך שמירה על טיפול אנזימטי למשך שלוש דקות.
יש לשלש את הכנת העורק הבסיסי כדי לשחרר תאים. לאחר מכן פיפטה ארבעה מיליליטר של תמיסת הפרדה קרה למבחנה שלוש כדי לסיים את התהליך האנזימטי. צנטריפוגה את התערובת בחום של 59 גרם למשך שש דקות.
בעזרת פיפטה, השליכו את הסופרנטנט. לאחר מכן הוסף שוב תמיסת הפרדה קרה. לאחר הכביסה האחרונה, הסר את הסופרנטנט.
השאירו מיליליטר אחד מתרחיף התאים. אחסן את תרחיף התאים בארבע מעלות צלזיוס למשך שש עד שמונה שעות. העבירו 100 מיקרוליטר מתלה התאים לאמבטיה.
הוסף מיליליטר אחד של נוזל חוץ תאי לאמבטיה ותן לו לנוח. כדי להתחיל, הפעל מיקרופיפט קוטבי. הניחו צינור זכוכית בקוטב.
בלוח הבקרה בחר תוכנית אחת. לחץ על Enter וגש לתוכנית הראשונה. כעת בצע בדיקת רמפה על ידי לחיצה על רמפה בלוח הבקרה כדי למדוד את ערך החום של צינור הזכוכית.
הכנס צינור זכוכית חדש. לאחר מכן בחר תוכנית אחת ולחץ על Enter כדי לייצר את המיקרו פיפטה. כדי לתעד את זרם הטיפול, הפעל תחילה את תוכנת רכישת הנתונים.
בחר קובץ ולאחר מכן לחץ על הגדר שמות קבצי נתונים כדי ליצור נתיב אחסון נתונים. הפעל את פונקציית בדיקת הממברנה בתפריט הכלים. הנח דגימה של תאי שריר חלק מבודדים מהעורק הבסיסי של חולדה במרכז תצוגת המצלמה של המיקרוסקופ.
טבלו את קצה חוט הייחוס בתמיסת האמבטיה. לאחר מכן מלאו 20% מהמיקרו פיפטה המפוברקת בתמיסה התוך-תאית. אבטח את המיקרו פיפטה הטעונה על מחזיק אלקטרודת ההקלטה.
עכשיו בעזרת מזרק, הפעל לחץ חיובי. העבר את קצה הפיפטה לתמיסת האמבטיה והתאם את היסט הפיפטה באות ampתוכנת חיים יותר כדי להגדיר את קו הבסיס הנוכחי לאפס פיקו-אמפר. לחץ בעדינות את הפיפטה על קרום התא.
שימו לב לעלייה בהתנגדות האיטום למגומה אחת לפחות. הסר לחץ חיובי והפעל לחץ שלילי. כדי לבסס התנגדות גבוהה, עם התנגדות איטום של לפחות ג'יגומה אחת, הגדר את מתח ההחזקה למינוס 60 מילי-וולט ופצה על קיבול האלקטרודות באמצעות CP FAST ו-CP slow.
הפעל לחץ שלילי קצר כדי לקרוע את קרום התא, וליצור תצורת תא שלמה. בחר תא שלם בתוכנת מגבר האות. לאחר מכן לחץ על אוטומטי לפיצוי קיבול הממברנה.
טען את פרוטוקול kir והתחל להקליט נתונים. בודדו תאי שריר חלק מבודדים טריים עם מורפולוגיה של ציר. התאים היו בריאים ומתאימים לניסויים במהדק טלאי.
זרם ריפוי טיפוסי הפגין יישור פנימה במתחים שליליים עם זרימת זרם יוני אשלגן מינימלית או ללא זרימת זרם במתחים חיוביים. בריום כלוריד בריכוזים של 100 עד 300 מיקרומול לליטר עיכב ביעילות את פעילות ערוץ קיר ואישר את הזרם כקיר. נתרן ניטרופרוסיד הגדיל את זרם הקיר המצביע על תפקידם של תעלות קיר בהרחבת כלי הדם המושרה על ידי SNP.
השוואה של יחסי מתח זרם הדגימה ירידה בצפיפות הזרם בנוכחות בריום כלוריד, ועלייה עם SNP.
