CAR T 细胞疗法在治疗某些病理性癌症方面取得了前所未有的成功。在这项研究中，我们引入了一种非病毒、长整合方法来产生瞬时 CAR T 细胞，并提供了评估 CAR T 细胞功能的靶向程序。我们的研究旨在以更具成本效益的方式生产安全有效的 CAR T 细胞。
CAR T 细胞通常由病毒转导产生。逆转录病毒和抗病毒药物是 CAR 基因递送最常见的病毒载体。病毒载体的生产复杂且成本高昂，病毒转导会诱导随机和永久性的 CAR 编码 DNA 整合到 T 细胞基因组中，这可能会导致安全问题。
我们的方案提供了一种非病毒方法来生成仅传递表达 CAR 的 CAR T 细胞。该方法使用 mRNA 进行 CAR 表达，并采用电穿孔将 mRNA 递送到 T 细胞中。这没有与 T 细胞基因组的基因整合，并且制造程序更简单且更具成本效益。
首先，用限制性内切酶 BGL2 线性化 CAR 质粒 DNA，并执行苯酚氯仿异戊醇 DNA 提取程序。纯化线性化 DNA 后，用琼脂糖凝胶电泳验证模板的大小和完整性。对于体外转录，混合反应组分并将反应混合物在 37 摄氏度下孵育至少两个小时。
转录后，向反应中加入两微升核糖核酸酶 III、DNase I。轻轻混匀并在 37 摄氏度下孵育 15 分钟，以降解模板 DNA。用 RNA 纯化试剂盒纯化转录的 CAR MRNA，并在无核酸酶的水中稀释。
使用分光光度计测量 mRNA 浓度，然后将其储存在零下 80 摄氏度。在冰上解冻体外转录和纯化的 car mRNA 样品。在 1 毫升 CAR T 培养基中悬浮 1 乘以 6 个 6 次冻存人外周血单核细胞的幂。
为了激活 T 细胞，添加等量的预洗人 T 激活剂 CD3/CD28 珠子。在 37 摄氏度下，在 5% 二氧化碳的加湿培养箱中培养和扩增细胞数天。将每孔 1 mL CAR T 培养基添加到 12 孔板的 2 个孔中，并在 37 摄氏度下孵育以达到平衡。
现在，将 5 乘以 10 的 6 个 T 细胞的幂转移到无菌管中。要去除 CD3/CD28 珠子，请将试管放在磁力架上，然后小心地将细胞悬液移液到新试管中。在室温下以 300 G 离心管 5 分钟。
弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于 1 毫升无菌 PBS 中。再次离心试管，将细胞沉淀重悬于 200 μL 的 Neon 缓冲液 T 中，混合 5 μg 在 Neon 缓冲液 T 中稀释的 CAR MNA 和 100 μL 细胞，总体积为 125 μL。将 25 微升 Neon 缓冲液 T 添加到剩余的 100 微升细胞中，作为阴性对照。
将 Neon 电穿孔系统设置为 1， 800 伏特、10 毫秒和单个脉冲。使用 Neon 移液器将 T 细胞 CAR mRNA 混合物吸入 Neon 100 μL 吸头中，然后对细胞进行电穿孔。立即将电穿孔的细胞转移到 12 孔板中的平衡培养基中，然后将板放回培养箱中以扩增细胞，直到它们准备好使用。
最早在电穿孔后 6 小时检索转染 CAR mRNA 的 T 细胞，用于流式细胞术分析。用移液管将 CAR T 细胞混合数次，并将至少 1 倍 10 倍到 5 个细胞的幂转移到 5 毫升荧光激活细胞分选或 FACS 管中。向试管中加入 3 mL 冷洗缓冲液，并在室温下以 500 G 离心试管 5 分钟。
弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于 100 μL 洗涤缓冲液中。向悬浮细胞中加入 2 微升荧光标记的检测抗体和 7 种 AAD 活力染料。混合样品并在冰上孵育 30 分钟，避免光照，然后用 3 毫升冷洗涤缓冲液洗涤细胞，并在室温下再次以 500 G 离心管 5 分钟。
弃去上清液后，将细胞重悬于 100 μL 洗涤缓冲液中，并立即使用流式细胞仪分析细胞。从细胞表面表达 CAR 抗原的肿瘤细胞中去除培养基。用 PBS 洗涤细胞后，将它们与 1 毫升 0.05% 胰蛋白酶 EDTA 溶液在 37 摄氏度下孵育 1 分钟，然后在适当的培养基中以 1 到 5 倍的密度制备单细胞悬液 10 倍，达到每毫升 5 个细胞的幂。
接下来，向 E 板中加入 50 微升预热的肿瘤细胞培养基，并将其置于实时细胞分析或 RTCA 仪器中，以测量背景阻抗，然后向每个孔中加入 100 微升肿瘤细胞悬液，并在室温下平衡板 30 分钟。将 E 板放回 RTCA 仪器中，监测细胞指数 24 小时，每 5 到 15 分钟测量一次。第二天，准备 CAR T 细胞悬液。
暂停细胞索引记录并从 RTCA 仪器中取出 E 板。稍微倾斜板，小心地从每个孔中取出 50 微升培养基，不要干扰肿瘤细胞，然后向每个孔中加入 100 微升 CAR T 细胞或对照 T 细胞。将 E 板放回 RTCA 仪器并恢复细胞索引监测至少 24 小时，每 5 到 15 分钟扫描一次。
停止细胞指数监测并分析细胞毒性结果。对于细胞因子分泌分析，将上清液从每个孔转移到圆底或 V 形 96 孔板中。在室温下以 300 G 离心 96 孔板 5 分钟，然后小心地将上清液转移到新的 96 孔板中。
最后，使用市售 ELISA 试剂盒测量上清液中的细胞因子水平。通过凝胶电泳验证 CAR mRNA 序列大小约为 2 kb。超过 50% 的活化 T 细胞在电穿孔后第 1 天表达 CAR，第 2 天增加到 70% 以上，然后在第 5 天下降到约 10%。
CAR T 细胞对 HER2 阳性 SK-OV-3 肿瘤细胞表现出显着的细胞毒性，表现为肿瘤阻抗急剧降低，而对照 T 细胞表现出最小的影响。在 CAR T 细胞培养基中检测到高水平的干扰素 γ 分泌，但在对照组中未检测到。
