我们的实验室设计人工免疫受体，如嵌合抗原受体，并研究它们如何影响调节性 T 细胞生物学。通过发明新的 DNA 序列和使用人源化小鼠疾病模型，我们的目标是为自身免疫性疾病、移植排斥反应、癌症和衰老创造工程化免疫细胞疗法。在为调节性 T 细胞设计嵌合抗原受体时，考虑其强度至关重要。
高亲和力 CAR Treg 的行为更像效应 T 细胞，产生更多的炎性细胞因子并表现出更强的杀伤活性。我们正在进行的研究表明，降低 CAR 亲和力可改善 CAR Tregs 中的细胞因子谱和功能。CAR Treg 领域尚处于起步阶段，缺乏标准化。
我们的协议引入了一种强大的通用方法来生成和测试 CAR Treg。这提高了可重复性并加快了创新速度，同时也为刚接触 CAR 调节性调节剂研究的实验室提供了指导，特别是考虑到调节性调节性调节剂稀缺性和特殊要求的挑战。我们研究了调节 T 细胞用于维持免疫平衡和促进组织愈合的机制。
我们的研究包括了解 CAR Treg 信号传导和功能，以及探索与当前策略相比，CAR Treg 疗法可能提供独特益处的新疾病背景。首先，将 leukopak 的内容物转移到 50 毫升锥形管中。加入等体积的 DPBS 和 2% 胎牛血清，并用移液管轻轻混合。
在室温下以 300 g 离心管 10 分钟。吸出上清液后，用 2% 胎牛血清在 2 毫升 DPBS 中重构细胞沉淀。然后，向细胞悬液中加入 8 毫升氯化铵溶液，轻轻倒置混匀。
折断后，将洗涤后的细胞在室温下以 150 g 离心 10 分钟。吸出上清液后，将细胞沉淀重悬于 30 毫升含 2% 胎牛血清的 DPBS 中。然后，在室温下以 500 g 的离心速度将 10 降至 8 到 10 的幂，达到 9 PBMC 的幂，持续 5 分钟。
并重悬于细胞分离缓冲液中，浓度为 5 倍 10 至 7 个细胞/毫升的幂。对于调节性 T 细胞的荧光辅助细胞分选，以 500 g 离心 CD4 阳性细胞 5 分钟。然后，在 200 μL DPBS 中重构细胞。
对于每 100 万个细胞，添加 1 微升抗人 CD4 FITC、1 微升抗人 CD25 APC 和 1 微升抗人 CD127 PE。轻轻涡旋试管后，将其置于 4 摄氏度的冰箱中 30 分钟。用 10 毫升含 2% 胎牛血清的 DPBS 洗涤细胞后，以 500 g 离心 5 分钟，然后以 1.5 乘以 10 的倍数轻轻重悬染色的细胞，达到含 2% 胎牛血清的 DPBS 中每毫升 7 个细胞的幂次方。接下来，将染色的细胞悬液通过 40 微米的过滤帽进入荧光辅助细胞分选管中。
准备含有 3 毫升 RPMI10 培养基的 15 毫升收集管，并将其置于冰上。最后，使用荧光辅助细胞分选对 CD4 阳性、CD25 高、CD127 阴性调节性 T 细胞和 CD4 阳性、CD25 低、CD127 阳性常规 T 细胞进行分类。首先，在激活后 48 小时从人血液中分离出调节性 T 细胞并重悬它们。
细胞计数后，在室温下以 500 g 离心 5 分钟。以 1.25 乘以 10 倍的 RPMI10 重悬调节性 T 细胞，达到每毫升 6 个细胞的幂，每毫升 1， 000 国际单位的白细胞介素-2。现在，将每个慢病毒等分试样加入微量离心管中 200 μL 中 5 个调节性 T 细胞的 2.5 倍 10。
在 1， 000 摄氏度下以 32 克离心接种 1 小时。将每个 200 μL 反应移至 24 孔板中。将板与转导的调节性 T 细胞在组织培养箱中孵育过夜。
用 RPMI10 培养基将每个孔加满至 2 毫升，最终白细胞介素 2 浓度为每毫升 1， 000 国际单位。使用流式细胞术评估基因修饰效率，如下所示。首先，在激活后 48 小时，将带有抗 CD3、CD28 珠子的重悬调节性 T 细胞放入 15 毫升锥形管中。
将细胞悬液在磁铁中孵育 3 分钟。在磁力架中，通过移液管将培养基中的细胞转移到新管中。去除磁珠后，让去珠的调节性 T 细胞在 RPMI10 中静置 2 小时。
然后，以 500 g 离心调节性 T 细胞 5 分钟。倾析上清液后，将细胞重悬于预热的还原血清培养基中，浓度为 4 乘以 10 倍，达到每毫升 6 个细胞的幂。将 100 μL 细胞分装在低蛋白结合的 1.5 mL 离心管中。
向每个样品中加入 20， 000 个感染倍数的嵌合抗原受体腺相关病毒并重悬。然后，将反应管在组织培养箱中孵育 1 小时。在孵育过程中，通过将 8.3 μL Cas9 蛋白添加到 2.5 μL 单向导 RNA 中，靶向追踪基因位点来制备 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白复合物。
充分混合组分后，将核糖核蛋白混合物在 37 摄氏度下在组织培养箱中孵育 15 分钟。接下来，用 3 毫升高渗透压电穿孔缓冲液填充新的电穿孔管。将装满的电穿孔管插入电穿孔系统的移液器站，直到听到咔嗒声。
在电穿孔系统中将电穿孔条件设置为 2， 200 伏特、20 毫秒、一个脉冲。与腺相关病毒孵育 1 小时后，在室温下用 300 g 病毒离心细胞 5 分钟。吸出上清液后，将细胞沉淀重悬于每个样品中 100 μL 电穿孔系统提供的细胞重悬缓冲液中。
然后，每个样品加入 10.8 μL 核糖核蛋白复合物，并用移液管充分混合，不产生气泡。现在，通过将移液器推到第二个挡块以打开夹具，插入 100 μL 电穿孔吸头。将移液器的顶部头放入电穿孔吸头中，直到夹具与活塞的安装杆牢固啮合。
逐渐松开按钮，同时保持对移液器的向下压力，以确保吸头紧贴，没有任何间隙。然后，将移液器按至第一个停止位置，并将电穿孔尖端浸入细胞核糖核蛋白混合物中。轻轻地将样品拉入移液器中，没有任何气泡。
将装有样品的电穿孔吸头的移液器垂直插入 E 管中，直到听到咔嗒声。确认人类调节性 T 细胞的最佳设置后，按触摸屏上的 Start（开始）对细胞进行电穿孔。等待触摸屏显示 complete。
轻轻移出移液器，立即将样品转移到准备好的六孔板中，每孔含有 2.5 毫升预热的不含抗生素的 RPMI10 培养基和白细胞介素-2。以线性运动轻轻摇动板后，将其放入组织培养箱中。第二天，16 到 18 小时后，用含抗生素的培养基更换培养基。
对电穿孔调节性 T 细胞进行计数，并以 10 到 6 个细胞/毫升的幂和每毫升 1， 000 国际单位的白细胞介素-2 培养。
