制造用于采用免疫疗法的奇美抗原受体（CAR）T细胞

脱利-at-at功能能力，在输液后，具有促进、增殖和cit-el-uric活性，是有效采用免疫疗法的关键组成部分。例如，在实体肿瘤中，CAR T细胞可以穿透实体肿瘤，并接受最佳的抗原刺激;然而，它们的整体感染和增殖在人体内受到阻碍。这种方法的主要好处是，它可以保留 CAR T 细胞的质量或 CAR T 细胞的分化状态，而无需产生最终分化或耗尽的 T 细胞，这将降低增殖能力或输液后的有效功能差。

这种技术可能很困难，因为T细胞对细胞浓度或培养的血管的表面面积非常敏感。以及他们的代谢需求。从本质上讲，T细胞需要在整个过程中保持快乐，否则它们不会生长。

要开始这个程序，请设置6个井文化菜肴。通过将新鲜或低温保存的原人类T细胞与抗CD3 CD28磁珠混合，在培养皿的井中，每T细胞三个珠子的比例激活它们。培养X-Vivo 15培养的T细胞，辅以正常人AB血清、L-谷氨酰胺、血尿和IL2。

在膨胀过程中，以每毫升一百万T细胞的浓度激活T细胞。在37摄氏度下培养它们，用20%的氧气、5%的二氧化碳和95%的湿度来培养它们。经过一夜的刺激，在激活的T细胞中加入扁病毒超自然。

计算达到三到五之间多重感染所需的超级钠的体积。使用相同的条件继续培养细胞。第三天，收集低温保存细胞的代表性等分。

在低温保存之前，通过轻轻移液和磁分离去除磁珠。准备含有 PBS 的冻结介质，其 0.5% DMSO。并储存在四摄氏度，直到准备使用。

接下来，将T细胞在300倍G下离心5分钟。丢弃上一杯，加入五毫升的PBS。以 300 次 G 再次离心细胞五分钟，然后丢弃 PBS。

我们把小气暂停在一毫升的冷低温保鲜介质中。将T细胞冷冻在冷冻容器中。并在零下80摄氏度下储存48小时。

在此之后，将冷冻细胞转移到液氮中。在五毫升PBS中清洗其余T细胞一次，以消除任何残留载体。在300次G下离心5分钟。

然后，以每毫升50万细胞的浓度，将PBS和T细胞培养中细胞的佩利暂停。将 T 细胞分成两个培养物，设计为 45 和 9。使用计数珠子和对人 CD4 和 CD8 的单克隆抗体，通过流式细胞法计算 T 细胞。

以及一种活力染料。每隔一天重新喂养培养物，以保持每毫升50万个细胞的浓度。第五天，计数和冷冻保存第五天文化，如前面描述。

第七天，用PBS清洗50万个细胞。并在100微升荧光激活细胞分选缓冲液中重新挂起它们。然后，通过免疫染色检测 CAR 表面蛋白表达，通过流式细胞学进行荧光结合抗 CAR 19 白痴型检测 CAR 表面蛋白表达。

第九天计数和冷冻保存第九天文化如前所述。在这项研究中，测量了在整个X-Vivo培养文化中以不同间隔采集的 CAR T细胞的功能和功效。使用本视频中描述的方法，T细胞被刺激和扩大三到九天。

此处所示的浇注策略所示的细胞分化轮廓通过测量细胞表面表达的明显糖蛋白的丰度进行分析。在 X-Vivo 培养过程中，逐渐向效应器分化转变。然后评估 CAR T细胞对抗原反应的效应函数和增殖能力。

扩展较少的细胞在功能上优于在较长持续时间内广泛培养的细胞。在人类异种移植小鼠模型中，比较了不同时间段收获的 CAR T 细胞的所有效力。九天细胞表现出一种依赖剂量的抗卢克反应，完全反应值300万;低剂量50万的疗效丧失。

然而，当天三个细胞显示持续肿瘤控制在高和低剂量。此反应与小鼠外周血液中 CAR-T 19 的绝对计数相关。总体而言，这些结果提供了证据，证明 CAR T 细胞的收获更早，优于后来收获的细胞。

按照这个程序，可以进行额外的功能检测，如海马测定，以测量其代谢特性，如氧气消耗或螺旋能力。也可以进行几轮再刺激，以深入了解其分化和 CAR T 细胞的持久性。以这项工作为基础，我们和其他研究人员正在从事研究，以进一步缩写文化过程。

它也可以扩展到其他癌症抗原的核心方法设计中。使用扁病毒时，必须始终小心。但是，即使扁病毒被设计为复制无能。