我们开发了一种强大的方案，可以在同一个果蝇大脑上进行多轮原位杂交，从而能够可视化许多不同基因的表达模式。将果蝇脑包埋在水凝胶中可确保在多轮杂交中实现出色的组织完整性和 mRNA 稳定性。它还显著提高了成像时的光学清晰度。
EASI-FISH 可被任何具有共聚焦或光片显微镜的实验室采用，以定义果蝇脑中细胞类型的基因表达谱。首先，用 RNA 去污试剂擦拭未带电的载玻片。撕下保护胶粘剂免受硅胶垫圈影响的不透明薄膜。
然后将包含最多四个腔室的垫圈粘附到载玻片上。使用 P20 移液器在每个腔室表面涂上 1 微升聚赖氨酸。接下来，每管最多将 4 个果蝇大脑转移到 0.2 毫升 PCR 管中。
在 150 微升含有 0.1% Triton X-100 的 PBS 中再水化大脑，然后是 PBS。向每个腔室中加入 40 微升 PBS。用一把细镊子，轻轻地将大脑排成一排，放在腔室的中心，在它们之间留出一些空间。
从腔室中取出 PBS，并立即加入 50 微升 20 毫摩尔 MOPS 缓冲液。当大脑在 MOPS 缓冲液中平衡时，将等体积的解冻的 Melphalan-X 移液到具有等体积 MOPS 缓冲液的试管中。然后以 1 比 100 的比例加入 Ac-X 储备液。
涡旋溶液并短暂旋转以收集它。从腔室中取出所有 MOPS 缓冲液，并加入 50 微升 Melphalan-X Ac-X 溶液。将盖玻片放在每个腔室的顶部，不要使用垫圈粘合剂进行密封。
然后将腔室放入加湿箱中。第二天，小心地取下盖玻片并吸出 Melphalan-X Ac-X 溶液。在 100 微升 0.1% PBT 中洗涤封固的大脑两次，然后用 100 微升 PBS 洗涤。
将 TREx-1000 4-羟基-TEMPO、TEMED 和过硫酸铵解冻的溶液置于冰上。涡旋 TREx-1000 溶液以确保没有沉淀。混合溶液以制备凝胶溶液并在结冰前涡旋。
使用移液器吸头，从腔室中取出 PBS，然后用无绒布吸走任何残留液体。立即在每个腔室的大脑上加入 40 微升凝胶溶液。将腔室在 4 摄氏度下孵育 10 分钟。
现在从腔室中取出凝胶溶液。然后从垫圈表面粘合剂上撕下透明的保护膜。最后加入 45 μL 新鲜凝胶溶液。
轻轻地将盖玻片盖在腔室上，然后按压盖玻片以密封腔室，然后在 4 摄氏度下再孵育 10 分钟。将腔室在 37 摄氏度下孵育 1.5 小时以聚合凝胶。在工作台上冷却凝胶后，使用剃须刀片小心地取下盖玻片和硅胶垫圈。
将凝胶修剪成矩形，并切开右上角以指示样品方向。接下来，使用蘸有少量 Pro K 缓冲液的细画笔小心地将凝胶从载玻片上提起。将每块凝胶单独转移到 2 mL 微量离心管中。
混合 500 μL Pro K 缓冲液和 5 μL 蛋白酶 K 酶，并将混合物添加到每块凝胶中。在 37 摄氏度下孵育过夜。第二天，用细小灵活的移液管去除缓冲液，然后在 PBS 中洗涤凝胶 3 次，每次 10 分钟。
将凝胶在 37 摄氏度下放入 1 mL DNASE1 缓冲液中孵育 30 分钟。将 50 μL DNASE1 酶与 450 μL DNASE1 缓冲液混合。轻轻混合，不要涡旋。
将每块凝胶在 500 μL DNASE1 溶液中于 37 摄氏度下孵育 2 小时。然后，在室温下用 1 mL PBS 洗涤凝胶 4 次，每次 15 分钟。现在，将凝胶在 500 μL 解冻的杂交缓冲液中（不含探针）在 37 °C 下孵育 30 分钟。
在杂交缓冲液中以 1 比 100 的比例稀释探针，每块凝胶制备 300 μL。将凝胶与含有探针的杂交缓冲液在 37 摄氏度下孵育过夜。第二天，先在探针洗涤缓冲液中洗涤凝胶，然后在 PBS 中洗涤凝胶。
对于杂交链式反应，向凝胶中加入 500 μL 扩增缓冲液，并在室温下孵育 30 分钟。在 PCR 机器中将荧光发夹在 95 摄氏度下加热 90 秒，然后将溶液冷却至 25 摄氏度 30 分钟。对于每个探针，在扩增缓冲液中以 1 比 50 的比例稀释匹配的发夹对，每块凝胶制备 300 μL。
涡旋混合物后，将混合物加入凝胶中并孵育。要封片用于光片成像，请在凝胶支架的凝胶附着面上涂上 1 微升聚赖氨酸两次，使其在两次涂层之间在 37 摄氏度下干燥。然后，将凝胶放在盖玻片上，使切口在左侧。
使用画笔，只需一个动作即可将凝胶转移到处理过的表面上。神经递质相关基因和神经肽基因在成年果蝇大脑中表现出不同的表达模式。VGluT 和 Gad1 在同一杂交轮中共检测到，显示出不重叠的表达模式。
AstA 在视叶中表达强烈，在中央复合体中表达较弱。Crz 在外侧部高表达，而在视叶神经元中观察到较低的表达水平。通过光片或共聚焦显微镜使用特异性分裂 GAL4 线在用 Mer-GFP 表达鉴定的 H delta D 神经元中检测到 Tk。
FMRFamide 在 Mer-GFP 标记的 PFG 神经元中不存在，但在周围神经元中检测到。FB4K 神经元的高分辨率成像证实了 VGluT 和 ChAT/VAChT 转录本的空间分布。神经肽（如 AstA 和 Crz）在某些细胞中高表达，以至于代表单个转录本的单个荧光点无法再分离。
