Wir haben ein robustes Protokoll entwickelt, bei dem mehrere Runden der In-situ-Hybridisierung am selben Drosophila-Gehirn durchgeführt werden können, um die Expressionsmuster vieler verschiedener Gene sichtbar zu machen. Die Einbettung des Fliegengehirns in ein Hydrogel gewährleistet eine hervorragende Gewebeintegrität und mRNA-Stabilität über mehrere Hybridisierungsrunden. Es verbessert auch die optische Klarheit bei der Bildgebung erheblich.
EASI-FISH kann von jedem Labor mit einem Konfokal- oder Lichtblattmikroskop eingesetzt werden, um Genexpressionsprofile von Zelltypen im Fliegengehirn zu definieren. Wischen Sie zunächst einen nicht geladenen Objektträger mit einem RNA-Dekontaminationsreagenz ab. Entfernen Sie die undurchsichtige Folie, die den Klebstoff schützt, von der Silikondichtung.
Kleben Sie dann die Dichtung mit bis zu vier Kammern auf den Schieber. Beschichten Sie jede Kammeroberfläche mit einer P20-Pipette mit einem Mikroliter Polylysin. Als nächstes überführen Sie bis zu vier Drosophila-Gehirne pro Röhrchen in ein 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen.
Rehydrieren Sie das Gehirn in 150 Mikrolitern PBS, das 0,1 % Triton X-100 enthält, gefolgt von PBS. Geben Sie 40 Mikroliter PBS in jede Kammer. Positionieren Sie die Gehirne mit einer feinen Pinzette vorsichtig in einer Reihe in der Mitte der Kammer und lassen Sie dabei etwas Platz zwischen ihnen.
Entfernen Sie PBS aus der Kammer und fügen Sie sofort 50 Mikroliter 20 Millimolar MOPS-Puffer hinzu. Während sich das Gehirn im MOPS-Puffer äquilibriert, pipettieren Sie gleiche Volumina des aufgetauten Melphalan-X in ein Röhrchen mit dem MOPS-Puffer des gleichen Volumens. Dann Ac-X Stammlösung im Verhältnis eins zu 100 zugeben.
Wirbeln Sie die Lösung und drehen Sie sie kurz, um sie aufzufangen. Entfernen Sie alle MOPS-Puffer aus den Kammern und fügen Sie 50 Mikroliter der Melphalan-X AC-X-Lösung hinzu. Legen Sie einen Deckglas auf jede Kammer, ohne den Dichtungskleber zum Abdichten zu verwenden.
Stellen Sie die Kammer dann in eine befeuchtete Box. Entfernen Sie am nächsten Tag vorsichtig den Deckglas und aspirieren Sie die Melphalan-X AC-X-Lösung. Waschen Sie das berittene Gehirn zweimal in 100 Mikrolitern 0,1 % PBT, gefolgt von 100 Mikrolitern PBS.
Auftaute Lösungen von TREx-1000 4-Hydroxy-TEMPO, TEMED und Ammoniumpersulfat auf Eis legen. Wirbeln Sie die TREx-1000-Lösung vor, um sicherzustellen, dass kein Niederschlag entsteht. Mischen Sie die Lösungen, um eine Gellösung herzustellen, und wirbeln Sie sie vor dem Vergießen ein.
Entfernen Sie das PBS mit einer Pipettenspitze aus der Kammer und leiten Sie die restliche Flüssigkeit mit einem fusselfreien Tuch ab. Geben Sie sofort 40 Mikroliter Gellösung über das Gehirn in jeder Kammer. Inkubieren Sie die Kammern 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius.
Entferne nun die Gellösung aus der Kammer. Ziehen Sie dann den durchsichtigen Schutzfilm vom Dichtungsflächenkleber ab. Fügen Sie die letzten 45 Mikroliter frische Gellösung hinzu.
Legen Sie vorsichtig einen Deckzettel über die Kammer und drücken Sie den Deckglas, um die Kammer zu verschließen, bevor Sie weitere 10 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren. Inkubieren Sie die Kammer 1,5 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, um das Gel zu polymerisieren. Nachdem Sie die Gele auf einer Bank abgekühlt haben, verwenden Sie eine Rasierklinge, um den Deckglas und die Silikondichtung vorsichtig zu entfernen.
Schneiden Sie das Gel in eine rechteckige Form und schneiden Sie die obere rechte Ecke aus, um die Ausrichtung der Probe anzuzeigen. Verwenden Sie anschließend einen feinen Pinsel, der mit einer kleinen Menge Pro K Puffer angefeuchtet ist, um die Gele vorsichtig von der Folie zu heben. Übertragen Sie jedes Gel einzeln in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.
Mischen Sie 500 Mikroliter Pro K Puffer und fünf Mikroliter Proteinase K Enzym und fügen Sie die Mischung zu jedem Gel hinzu. Inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie am nächsten Tag den Puffer mit einer feinen flexiblen Pipette und waschen Sie die Gele dann dreimal für jeweils 10 Minuten in PBS.
Inkubieren Sie die Gele 30 Minuten lang in einem Milliliter DNASE1-Puffer bei 37 Grad Celsius. Mischen Sie 50 Mikroliter DNASE1-Enzym mit 450 Mikrolitern DNASE1-Puffer. Schonend mischen, ohne zu wirbeln.
Inkubieren Sie jedes Gel zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius in 500 Mikrolitern DNASE1-Lösung. Waschen Sie die Gele dann viermal für 15 Minuten mit einem Milliliter PBS bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie nun die Gele in 500 Mikrolitern aufgetautem Hybridisierungspuffer ohne Sonden für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius.
Verdünnen Sie die Sonden in Hybridisierungspuffer im Verhältnis eins zu 100 und bereiten Sie 300 Mikroliter pro Gel vor. Inkubieren Sie die Gele mit einem Hybridisierungspuffer, der Sonden enthält, über Nacht bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie die Gele am nächsten Tag zuerst in Probe Wash Buffer, dann in PBS.
Für die Hybridisierungskettenreaktion geben Sie 500 Mikroliter Amplifikationspuffer in das Gel und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Erhitzen Sie die fluoreszierenden Haarnadeln in einem PCR-Gerät 90 Sekunden lang auf 95 Grad Celsius und kühlen Sie die Lösung 30 Minuten lang auf 25 Grad Celsius ab. Verdünnen Sie für jede Sonde übereinstimmende Haarnadelpaare im Verhältnis eins zu 50 in Amplifikationspuffer und bereiten Sie 300 Mikroliter pro Gel vor.
Nachdem Sie die Mischung vortext haben, geben Sie die Mischung zu den Gelen und inkubieren Sie. Um das Gel für die leichte Blattbildgebung zu montieren, beschichten Sie die Gel-Anhaftfläche eines Gelhalters zweimal mit einem Mikroliter Polylysin und lassen Sie es zwischen den Schichten bei 37 Grad Celsius trocknen. Lege dann das Gel auf einen Deckschirm, so dass sich der Schnitt auf der linken Seite befindet.
Übertragen Sie das Gel mit einem Pinsel in einer Bewegung auf die behandelte Oberfläche. Neurotransmitter-assoziierte Gene und Neuropeptid-Gene zeigten unterschiedliche Expressionsmuster im adulten Drosophila-Gehirn. VGluT und Gad1 wurden in derselben Hybridisierungsrunde gemeinsam detektiert und zeigten nicht überlappende Expressionsmuster.
AstA zeigte eine starke Expression im Sehlappen und eine schwächere Expression im zentralen Komplex. Crz wurde in der Pars lateralis stark exprimiert, während niedrigere Expressionsniveaus in Neuronen des Sehlappens beobachtet wurden. Tk wurde in H-Delta-D-Neuronen nachgewiesen, die mit Mer-GFP-Expression unter Verwendung einer spezifischen gespaltenen GAL4-Linie entweder durch Lichtblatt- oder konfokale Mikroskopie identifiziert wurden.
FMRFamid fehlte in PFG-Neuronen, die mit Mer-GFP markiert waren, wurde aber in umgebenden Neuronen nachgewiesen. Hochauflösende Bildgebung von FB4K-Neuronen bestätigte die räumliche Verteilung von VGluT- und ChAT/VAChT-Transkripten. Neuropeptide wie AstA und Crz werden in einigen Zellen so stark exprimiert, dass einzelne fluoreszierende Flecken, die einzelne Transkripte repräsentieren, nicht mehr getrennt werden können.
