Мы разработали надежный протокол, в котором можно провести несколько раундов гибридизации in situ на одном и том же мозге дрозофилы, что позволяет визуализировать паттерны экспрессии многих различных генов. Встраивание мозга мухи в гидрогель обеспечивает превосходную целостность тканей и стабильность мРНК в течение нескольких раундов гибридизации. Это также значительно улучшает оптическую четкость при визуализации.
EASI-FISH может быть принят любой лабораторией с конфокальным или световым листовым микроскопом для определения профилей экспрессии генов типов клеток в мозге мухи. Для начала протрите незаряженное предметное стекло реагентом для обеззараживания РНК. Снимите с силиконовой прокладки непрозрачную пленку, защищающую клей.
Затем приклейте к затвору прокладку, содержащую до четырех камер. С помощью пипетки P20 покройте поверхность каждой камеры одним микролитром полилизина. Затем перенесите до четырех мозгов дрозофилы в одну пробирку объемом 0,2 миллилитра для ПЦР.
Регидратируйте мозг в 150 микролитрах PBS, содержащих 0,1% Triton X-100, а затем PBS. Добавьте по 40 микролитров PBS в каждую камеру. С помощью тонкого пинцета аккуратно расположите мозги в ряд в центре камеры, оставив между ними некоторое пространство.
Извлеките PBS из камеры и сразу же добавьте 50 микролитров 20 миллимолярного буфера MOPS. Пока мозг уравновешивается в буфере MOPS, пипетка равного объема размороженного Melphalan-X в пробирку с буфером MOPS равного объема. Затем добавьте стоковый раствор Ac-X в соотношении один к 100.
Сделайте раствор вихрем и кратковременно раскрутите его, чтобы собрать. Удалите весь буфер MOPS из камер и добавьте 50 микролитров раствора Melphalan-X Ac-X. Поместите крышку на верхнюю часть каждой камеры, не используя клей для герметизации.
Затем поместите камеру во увлажненную коробку. На следующий день осторожно снимите крышку и аспирируйте раствор Мелфалан-Х Ас-Х. Дважды промойте смонтированные мозги в 100 микролитрах 0,1% PBT, затем 100 микролитрами PBS.
Размороженные растворы TREx-1000 4-Hydroxy-TEMPO, TEMED и персульфата аммония поместить на лед. Сделайте вихревую обработку раствора TREx-1000, чтобы убедиться в отсутствии осадка. Смешайте растворы для приготовления гелевого раствора и вортекса перед обледенением.
С помощью наконечника для дозатора извлеките PBS из камеры и удалите остатки жидкости с помощью безворсовой салфетки. Сразу же добавьте по 40 микролитров гелевого раствора поверх мозгов в каждой камере. Инкубируйте камеры при температуре четыре градуса Цельсия в течение 10 минут.
Теперь удалите раствор геля из камеры. Затем снимите прозрачную защитную пленку с поверхностного клея прокладки. Добавьте в итог 45 микролитров свежего раствора геля.
Аккуратно наденьте крышку на камеру и нажмите на защитную крышку, чтобы закрыть камеру, перед инкубацией при четырех градусах Цельсия в течение еще 10 минут. Инкубируйте камеру при температуре 37 градусов Цельсия в течение 1,5 часов для полимеризации геля. После охлаждения гелей на скамейке с помощью бритвенного лезвия аккуратно снимите чехол и силиконовую прокладку.
Обрежьте гель в прямоугольную форму и обрежьте верхний правый угол, чтобы указать ориентацию образца. Затем используйте тонкую кисть, смоченную небольшим количеством буфера Pro K, чтобы осторожно снять гели со предметного стекла. Перелейте каждый гель по отдельности в двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку.
Смешайте 500 микролитров буфера Pro K и пять микролитров фермента Proteinase K, и добавьте смесь в каждый гель. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи. На следующий день удалите буфер тонкой гибкой пипеткой, а затем промойте гели три раза в PBS по 10 минут каждый.
Инкубируйте гели в течение 30 минут в одном миллилитре буфера DNASE1 при температуре 37 градусов Цельсия. Смешайте 50 микролитров фермента DNASE1 с 450 микролитрами буфера DNASE1. Аккуратно перемешайте, не завихривая.
Инкубируйте каждый гель в 500 микролитрах раствора DNASE1 в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия. Затем промойте гели четыре раза в течение 15 минут одним миллилитром PBS комнатной температуры. Теперь инкубируйте гели в 500 микролитрах размороженного буфера для гибридизации без зондов в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия.
Разведите зонды в буфере для гибридизации в соотношении один к 100, приготовив 300 микролитров на гель. Инкубируйте гели с буфером для гибридизации, содержащим зонды, в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. На следующий день промойте гели сначала в буфере для промывки зонда, затем в PBS.
Для проведения цепной реакции гибридизации добавьте в гель 500 микролитров амплификационного буфера и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре. Нагрейте флуоресцентные шпильки при температуре 95 градусов Цельсия в течение 90 секунд в ПЦР-аппарате и охладите раствор до 25 градусов Цельсия в течение 30 минут. Для каждого зонда разведите подходящие пары шпилек в соотношении один к 50 в буфере для усиления, приготовив 300 микролитров на гель.
После вортексирования смеси добавьте смесь в гели и инкубируйте. Чтобы закрепить гель для легкой листовой визуализации, дважды покройте поверхность крепления геля гелевого держателя одним микролитром полилизина, дав ему высохнуть при температуре 37 градусов Цельсия между слоями. Затем нанесите гель на покровный лист так, чтобы разрез был с левой стороны.
С помощью кисти перенесите гель на обработанную поверхность одним движением. Гены, связанные с нейротрансмиттерами и нейропептидами, демонстрировали различные паттерны экспрессии в мозге взрослой дрозофилы. VGluT и Gad1 были совместно обнаружены в одном и том же раунде гибридизации, демонстрируя неперекрывающиеся паттерны экспрессии.
AstA показал сильную экспрессию в оптической доле и более слабую экспрессию в центральном комплексе. Crz был высоко экспрессирован в pars lateralis, в то время как более низкие уровни экспрессии наблюдались в нейронах зрительной доли. Tk был обнаружен в нейронах H. delta D, идентифицированных с экспрессией Mer-GFP, с использованием специфической расщепленной линии GAL4 с помощью светового листа или конфокальной микроскопии.
FMRFamide отсутствовал в нейронах PFG, отмеченных Mer-GFP, но обнаруживался в окружающих нейронах. Визуализация нейронов FB4K с высоким разрешением подтвердила пространственное распределение транскриптов VGluT и ChAT/VAChT. Нейропептиды, такие как AstA и Crz, настолько высоко экспрессируются в некоторых клетках, что отдельные флуоресцентные пятна, представляющие собой отдельные транскрипты, больше не могут быть разделены.
