Nous avons développé un protocole robuste où plusieurs cycles d’hybridation in situ peuvent être effectués sur le même cerveau de drosophile, permettant de visualiser les modèles d’expression de nombreux gènes différents. L’intégration du cerveau de la mouche dans un hydrogel garantit une excellente intégrité tissulaire et une stabilité de l’ARNm sur plusieurs cycles d’hybridation. Il améliore également considérablement la clarté optique lors de l’imagerie.
EASI-FISH peut être adopté par n’importe quel laboratoire avec un microscope confocal ou à feuillet de lumière pour définir les profils d’expression génique des types de cellules dans le cerveau de la mouche. Pour commencer, essuyez une lame non chargée avec un réactif de décontamination à l’ARN. Retirez le film opaque protégeant l’adhésif du joint en silicone.
Collez ensuite le joint contenant jusqu’à quatre chambres sur la glissière. À l’aide d’une pipette P20, enduire chaque surface de chambre d’un microlitre de polylysine. Ensuite, transférez jusqu’à quatre cerveaux de drosophile par tube dans un tube PCR de 0,2 millilitre.
Réhydratez les cerveaux dans 150 microlitres de PBS contenant 0,1 % de Triton X-100 suivi de PBS. Ajoutez 40 microlitres de PBS dans chaque chambre. À l’aide d’une pince à épiler fine, positionnez doucement les cerveaux en rangée au centre de la chambre, en laissant un peu d’espace entre eux.
Retirez le PBS de la chambre et ajoutez immédiatement 50 microlitres de tampon MOPS de 20 millimolaires. Pendant que les cerveaux s’équilibrent dans le tampon MOPS, pipetez des volumes égaux de Melphalan-X décongelé dans un tube avec un tampon MOPS de volume égal. Ajoutez ensuite la solution mère Ac-X dans un rapport de un à 100.
Vortex la solution et faites-la tourner brièvement pour la récupérer. Retirez tout le tampon MOPS des chambres et ajoutez 50 microlitres de la solution Melphalan-X Ac-X. Placez une lamelle sur le dessus de chaque chambre sans utiliser l’adhésif du joint pour l’étanchéité.
Placez ensuite la chambre dans une boîte humidifiée. Le lendemain, retirez délicatement la lamelle et aspirez la solution Melphalan-X Ac-X. Lavez les cerveaux montés deux fois dans 100 microlitres de PBT à 0,1 %, suivis de 100 microlitres de PBS.
Placez les solutions décongelées de TREx-1000 4-Hydroxy-TEMPO, de TEMED et de persulfate d’ammonium sur de la glace. Vortex la solution TREx-1000 pour s’assurer qu’il n’y a pas de précipité. Mélangez les solutions pour préparer une solution de gel et vortex avant de glacer.
À l’aide d’une pointe de pipette, retirez le PBS de la chambre et évacuez tout liquide résiduel avec une lingette non pelucheuse. Ajoutez immédiatement 40 microlitres de solution de gel sur les cerveaux de chaque chambre. Incuber les chambres à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.
Retirez maintenant la solution de gel de la chambre. Ensuite, décollez le film protecteur transparent de l’adhésif de surface du joint. Ajoutez 45 microlitres de solution de gel frais.
Placez délicatement une lamelle sur la chambre et appuyez dessus pour sceller la chambre avant de l’incuber à quatre degrés Celsius pendant encore 10 minutes. Incuber la chambre à 37 degrés Celsius pendant 1,5 heure pour polymériser le gel. Après avoir refroidi les gels sur un banc, utilisez une lame de rasoir pour retirer soigneusement la lamelle de recouvrement et le joint en silicone.
Coupez le gel en une forme rectangulaire et coupez le coin supérieur droit pour indiquer l’orientation de l’échantillon. Ensuite, utilisez un pinceau fin imbibé d’une petite quantité de tampon Pro K pour retirer délicatement les gels de la lame. Transférez chaque gel individuellement dans un tube de microcentrifugation de deux millilitres.
Mélangez 500 microlitres de tampon Pro K et cinq microlitres d’enzyme Protéinase K, et ajoutez le mélange à chaque gel. Incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, retirez le tampon à l’aide d’une pipette fine et flexible, puis lavez les gels trois fois dans du PBS pendant 10 minutes chacun.
Incuber les gels pendant 30 minutes dans un millilitre de tampon DNASE1 à 37 degrés Celsius. Mélangez 50 microlitres d’enzyme DNASE1 avec 450 microlitres de tampon DNASE1. Mélangez doucement sans vortex.
Incuber chaque gel dans 500 microlitres de solution DNASE1 pendant deux heures à 37 degrés Celsius. Ensuite, lavez les gels quatre fois pendant 15 minutes avec un millilitre de PBS à température ambiante. Maintenant, incubez les gels dans 500 microlitres de tampon d’hybridation décongelé sans sondes pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.
Diluer les sondes dans le tampon d’hybridation dans un rapport de un à 100, en préparant 300 microlitres par gel. Incuber les gels avec un tampon d’hybridation contenant des sondes pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, lavez d’abord les gels dans un tampon de lavage de sonde, puis dans du PBS.
Pour la réaction en chaîne d’hybridation, ajoutez 500 microlitres de tampon d’amplification au gel et incubez pendant 30 minutes à température ambiante. Chauffez les épingles à cheveux fluorescentes à 95 degrés Celsius pendant 90 secondes dans un appareil PCR et refroidissez la solution à 25 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pour chaque sonde, diluez les paires d’épingles à cheveux correspondantes dans un rapport de un à 50 dans le tampon d’amplification, en préparant 300 microlitres par gel.
Après avoir vortex le mélange, ajoutez le mélange aux gels et incuber. Pour monter le gel pour l’imagerie en feuille légère, enduisez deux fois la surface de fixation du gel d’un porte-gel avec un microlitre de polylysine, en le laissant sécher à 37 degrés Celsius entre les couches. Ensuite, placez le gel sur une lamelle de protection de manière à ce que la coupe soit sur le côté gauche.
À l’aide d’un pinceau, transférez le gel sur la surface traitée en un seul mouvement. Les gènes associés aux neurotransmetteurs et les gènes neuropeptides présentaient des profils d’expression distincts dans le cerveau de la drosophile adulte. VGluT et Gad1 ont été codétectés dans le même cycle d’hybridation, montrant des profils d’expression ne se chevauchant pas.
AstA a montré une forte expression dans le lobe optique et une expression plus faible dans le complexe central. Crz était fortement exprimé dans la pars lateralis, tandis que des niveaux d’expression plus faibles ont été observés dans les neurones du lobe optique. Tk a été détecté dans les neurones H delta D identifiés avec l’expression de Mer-GFP à l’aide d’une ligne GAL4 scindée spécifique par microscopie à feuillet de lumière ou confocale.
FMRFamide était absent dans les neurones PFG marqués par Mer-GFP, mais détecté dans les neurones environnants. L’imagerie à haute résolution des neurones FB4K a confirmé la distribution spatiale des transcrits VGluT et ChAT/VAChT. Les neuropeptides, tels que AstA et Crz, sont si fortement exprimés dans certaines cellules que les points fluorescents individuels représentant des transcrits uniques ne peuvent plus être séparés.
