在我们的研究中，我们研究了细胞外基质的机械特性对细胞行为和组织完整性的影响。我们想了解细胞与其微环境之间的相互作用如何影响转移形成等病理过程。通过对肺基底膜的机械特性进行数据挖掘，我们发现较软的基底膜对癌细胞侵袭的抵抗力更强。
我们的方案中介绍的方法能够对未固定的生物样品进行冷冻切片和机械研究，从而保持机械性能。此外，它展示了一种通过我们的协议中描述的原子力显微镜测量和过滤程序来确定肺泡壁内基底膜的杨氏模量的方法。下一步是更多地了解基底膜刚度的动力学及其在发育和病理过程中的作用，以潜在地改进诊断和指导治疗方案。
首先，从零下 80 摄氏度的冰箱中取出含有冷冻最佳切割温度 （OCT） 化合物包埋小鼠肺组织的模具。将双面胶带放在磨砂边缘显微镜载玻片的中心。将 15 毫升离心管卷在胶带上，以确保粘合牢固且无气泡。
确保磁带的长度与包含样本的 OCT 块的宽度相匹配。用铅笔标记幻灯片，包括示例信息和章节编号。将准备好的显微镜载玻片插入载玻片盒中。
将载玻片盒放入冷冻切片机腔室内以冷却载玻片。接下来，用 OCT 培养基填充样品架的内两个环。将样品放在样品架上的 OCT 培养基中。
将样品架置于冻存室中约 10 分钟，直到 OCT 培养基完全凝固且样品牢固固定。现在，将样品架安装到低温切片机的切割台上。用凉爽的拇指用力按压，将一块单面胶带贴在样品上。
使用冷冻切片机产生 15 微米的组织切片。使用刷子引导切片并防止胶带在切割过程中脱落。使用带有双面胶带的冷藏显微镜载玻片，并将其用力压在切片上以将其拾取。
将携带该切片的载玻片放回载玻片盒中。要使用热噪声方法校准悬臂，请将显微镜载玻片放在原子力显微镜 （AFM） 的样品台上。将 AFM 头放在样品台上。
然后使用步进电机降低 AFM 头，直到悬臂支架和显微镜载玻片之间的间隙约为 1 到 2 毫米。使用带有长针头的 1 毫升注射器将 PBS 涂抹在悬臂支架的侧面，使其向动并在间隙中形成液体弯月面。在 AFM 控制软件中，要执行基于接触的校准，请导航到 Acquire Data 页面并选择 Advanced View 选项。
通过单击位于右上角的 burger 菜单按钮来访问校准管理器。然后选择 Contact-based 作为方法，并从 Name 下拉菜单中选择 MLCT-F cantilever 作为悬臂名称。在 Setpoint 字段中输入 1 伏特，在 Number of scans 字段中输入 10。
在 Acquire Data 页面上，在左侧控制面板中为自动接近程序输入 1 伏特的设定值。单击界面左上角的蓝色向下箭头按钮以启动自动进近。当方法完成并且悬臂与显微镜载玻片接触时，单击 Calibration Manager 窗口中的 Calibrate 按钮开始校准。
校准完成后，关闭 Calibration Manager 窗口，并确保在预选目录中生成一个校准文件，其中包含确定的校准结果。首先，从冰箱中取出包含切片小鼠肺组织的标本载玻片。将显微镜载玻片放在 AFM 的样品台上。
单击用户界面右上角带有扳手图标的按钮，导航到 Settings Manager。在 Approach Settings 部分中，将 Target Height 设置为 4 微米。然后在 Advanced Feedback Settings 下的 Current Mode Settings 部分中，将乘数设置为 1。
在 Current Mode Settings 的 Force Settings 子部分中，从 Mode at end 下拉菜单中选择 Retracted Piezo。在左侧控制面板中，设置力缩进曲线的参数。对于 NanoWizard 4 XP 和 MLCT 悬臂 F，输入设定点为 5 纳牛顿，Z 长度为 8 微米，Z 速度为 300 微米/秒。
接下来，定义初始总览力图的位置和大小，以包含整个牙槽壁，从一侧空气侧延伸到另一侧空气侧。将像素数设置为 50 x 50。记录概览图后，在基底膜上捕获尺寸为 3 x 3 微米或 4 x 4 微米的更聚焦的力图，将像素数保持在 50 x 50 曲线。
要分析力压痕曲线，请在 MATLAB 中启动 CANTER Processing Toolbox，然后打开 Force Curve Analysis 应用程序。然后，要加载肺切片的高分辨率力图，请单击 Select File（选择文件），导航到保存位置，双击该文件，然后选择 Load Data（加载数据）。当出现请求悬臂校准值的弹出窗口时，在相应的编辑字段中输入校准值。
单击 Submit 按钮继续。在第二个弹出窗口中，单击“提交”按钮继续进行定量成像或 QI 映射的加载过程。加载过程完成后，力图的初始力曲线将显示在屏幕上。
在相应的编辑字段中将拟合深度设置为 1.5 微米，并为触点查找器算法选择通过 Hertz 拟合。要将修改后的 Hertz 模型的拟合应用于 QI 地图的所有力压痕曲线，请单击 Keep Apply to all 按钮。完成最后一次力曲线分析后，将出现一个窗口以保存文件。
单击 Yes 并输入结果文件的名称。要从 CANTER Processing Toolbox 的 Application Selection 窗口对 QI 映射进行空间过滤，请选择 Result Filtering Tool 并单击 Start Application 按钮。要加载拟合结果，请单击 Result Filtering Tool 用户界面顶部菜单栏中的 Open。
在随后的弹出窗口中，找到 JPK Maps 选项卡下的第一个 Set 按钮，然后选择包含力曲线分析结果的 tsv 文件。然后单击第二个 Set 按钮并找到与所选 tsv 文件对应的 QI 映射文件。随后，单击 Submit 以加载地图数据和力曲线分析结果。
从顶部的 Displayed channel 下拉菜单中，选择 EModul 选项以将杨氏模数结果显示为映射图像。然后，从直方图下方的 Data channel 下拉菜单中选择 EModul 选项，以可视化 QI 映射的加载杨氏模量值的分布。接下来，单击用户界面中央的 Manipulation flow 箭头按钮，确保它指向右侧。
将 Image filter 切换按钮设置为 Filter 面板中直方图轴上方的 On 位置。从 Filter geometry 下拉菜单中选择 Freehand 选项，然后单击 Add 按钮。在顶部通道图像上，通过在按住鼠标左键的同时环绕基底膜来绘制滤镜蒙版。
完成后松开鼠标按钮并双击蒙版以将其应用于地图。要保存带有掩码杨氏模量值的新 tsv 结果文件，请单击顶部菜单栏中的 Save （保存）、Save histogram （保存直方图） 和 Save data （保存数据）。在出现的弹出窗口中，单击 Select all 以选择要写入 tsv 文件的结果。
然后点击 OK 按钮确认选择。在 Save 对话框中输入 tsv 文件的名称，选择所需的保存位置，然后单击 OK 保存筛选的结果。肺基底膜的杨氏模量呈对数正态分布，峰值为 9.31，标准差为 0.18，具有代表性的杨氏模量为 11.05 千帕。
分位数-分位数图进一步证实了这些发现。
