In unserer Forschung untersuchen wir den Einfluss der mechanischen Eigenschaften der extrazellulären Matrix auf das Zellverhalten und die Gewebeintegrität. Wir wollen verstehen, wie sich das Zusammenspiel zwischen Zellen und ihrer Mikroumgebung auf krankhafte Prozesse wie die Metastasenbildung auswirkt. Durch Data Mining der mechanischen Eigenschaften der pulmonalen Basalmembran haben wir herausgefunden, dass weichere Basalmembranen widerstandsfähiger gegen das Eindringen von Krebszellen sind.
Die in unserem Protokoll vorgestellte Methode ermöglicht die Kryosektion und mechanische Untersuchung von nicht fixierten biologischen Proben, wobei die mechanischen Eigenschaften erhalten bleiben. Darüber hinaus zeigt es einen Weg, den Elastizitätsmodul ausschließlich der Basalmembran innerhalb der Alveolarwand durch eine Rasterkraftmikroskop-Messung und Filterverfahren zu bestimmen, die in unserem Protokoll beschrieben sind. Der nächste Schritt besteht darin, mehr über die Dynamik der Basalmembransteifigkeit und ihre Rolle in Entwicklungs- und pathologischen Prozessen zu erfahren, um möglicherweise die Diagnostik zu verbessern und Behandlungsoptionen zu leiten.
Entfernen Sie zunächst die Form, die das gefrorene OCT-Compound (Optimal Cutting Temperature) enthält, aus dem Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius. Legen Sie doppelseitiges Klebeband in die Mitte des Mikroskopobjektträgers mit mattierten Kanten. Rollen Sie ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen über das Klebeband, um eine feste und blasenfreie Haftung zu gewährleisten.
Stellen Sie sicher, dass die Länge des Bandes mit der Breite des OCT-Blocks übereinstimmt, der die Probe enthält. Beschriften Sie die Folien mit einem Bleistift, einschließlich der Beispielinformationen und der Abschnittsnummern. Legen Sie die vorbereiteten Objektträger in eine Objektträgerbox ein.
Platzieren Sie die Objektträgerbox in der Kryotomkammer, um die Objektträger zu kühlen. Füllen Sie anschließend die inneren beiden Ringe des Probenhalters mit OCT-Medium. Positionieren Sie die Probe innerhalb des OCT-Mediums auf dem Probenhalter.
Stellen Sie den Probenhalter für ca. 10 Minuten in die Kryotomkammer, bis das OCT-Medium vollständig erstarrt ist und die Probe fest fixiert ist. Setzen Sie nun den Probenhalter auf den Schneidtisch des Kryotoms ein. Befestigen Sie ein Stück einseitiges Klebeband an der Probe, indem Sie es mit einem kühlen Daumen fest andrücken.
Erstellen Sie einen 15-Mikrometer-Gewebeschnitt mit dem Kryotom. Verwenden Sie eine Bürste, um den Abschnitt zu lenken und zu verhindern, dass sich das Klebeband während des Schneidevorgangs löst. Verwenden Sie einen gekühlten Objektträger mit doppelseitigem Klebeband und drücken Sie ihn fest auf den Schnitt, um ihn aufzunehmen.
Setzen Sie die Rutsche mit dem Abschnitt zurück in die Schiebebox. Um den Cantilever-Mikroskop mit der Methode des thermischen Rauschens zu kalibrieren, legen Sie einen Objektträger auf den Probentisch des Rasterkraftmikroskops (Rasterkraftmikroskops). Platzieren Sie den AFM-Kopf auf dem Probentisch.
Senken Sie dann den AFM-Kopf mit den Schrittmotoren ab, bis der Abstand zwischen dem Auslegerhalter und dem Objektträger etwa ein bis zwei Millimeter beträgt. Tragen Sie PBS mit einer Ein-Milliliter-Spritze mit einer langen Nadel seitlich auf den Auslegerhalter auf, so dass es nach unten fließen und einen Flüssigkeitsmeniskus im Spalt bilden kann. Um eine kontaktbasierte Kalibrierung durchzuführen, navigieren Sie in der AFM-Steuerungssoftware zur Seite "Daten erfassen" und wählen Sie die Option "Erweiterte Ansicht" aus.
Greifen Sie auf den Kalibrierungsmanager zu, indem Sie auf die Schaltfläche "Burger-Menü" in der oberen rechten Ecke klicken. Wählen Sie dann Kontaktbasiert als Methode und MLCT-F Cantilever aus dem Dropdown-Menü Name als Cantilever-Name aus. Geben Sie ein Volt in das Feld "Sollwert" und 10 in das Feld "Anzahl der Scans" ein.
Geben Sie auf der Seite "Daten erfassen" im linken Bedienfeld einen Sollwert von einem Volt für das automatische Annäherungsverfahren ein. Klicken Sie auf die blaue, nach unten zeigende Pfeilschaltfläche in der oberen linken Ecke der Benutzeroberfläche, um die automatische Annäherung zu starten. Wenn der Ansatz abgeschlossen ist und der Cantilever mit dem Objektträger in Kontakt kommt, klicken Sie im Fenster Kalibrierungs-Manager auf die Schaltfläche Kalibrieren, um die Kalibrierung zu starten.
Schließen Sie nach Abschluss der Kalibrierung das Fenster des Kalibrierungsmanagers und stellen Sie sicher, dass eine Kalibrierungsdatei im vorausgewählten Verzeichnis mit den ermittelten Kalibrierungsergebnissen generiert wird. Nehmen Sie zunächst den Objektträger mit geschnittenem Lungengewebe von Mäusen aus dem Gefrierschrank. Legen Sie den Objektträger auf den Probentisch des AFM.
Klicken Sie auf die Schaltfläche mit dem Schraubenschlüsselsymbol in der oberen rechten Ecke der Benutzeroberfläche, um zum Einstellungsmanager zu navigieren. Stellen Sie im Abschnitt Anflugeinstellungen die Zielhöhe auf vier Mikrometer ein. Legen Sie dann im Abschnitt Einstellungen für den aktuellen Modus unter Erweiterte Feedback-Einstellungen den Multiplikator auf eins fest.
Wählen Sie im Unterabschnitt "Force Settings" der "Current Mode"-Einstellungen die Option "Retracted Piezo" aus dem Dropdown-Menü "Mode at end" aus. Legen Sie im linken Bedienfeld die Parameter für die Krafteinrückungskurven fest. Für den NanoWizard 4 XP und den MLCT-Cantilever-Cantilever: Sollwert für F auf fünf Nanonewton, Z-Länge auf acht Mikrometer und Z-Geschwindigkeit auf 300 Mikrometer pro Sekunde.
Definieren Sie als Nächstes die Position und Größe der anfänglichen Übersichtskraftkarte so, dass sie die gesamte Alveolarwand umfasst, die sich von einer Luftseite zur anderen erstreckt. Legen Sie die Anzahl der Pixel auf 50 x 50 fest. Nehmen Sie nach der Aufzeichnung der Übersichtskarte eine fokussiertere Kraftkarte mit einer Größe von entweder drei mal drei Mikrometern oder vier mal vier Mikrometern auf der Basalmembran auf, wobei die Anzahl der Pixel bei 50 x 50 Kurven bleibt.
Um Krafteindruckkurven zu analysieren, starten Sie die CANTER Processing Toolbox in MATLAB und öffnen Sie die Anwendung Force Curve Analysis. Um dann die hochauflösende Kraftkarte des Lungenabschnitts zu laden, klicken Sie auf Datei auswählen, navigieren Sie zum Speicherort, doppelklicken Sie auf die Datei und wählen Sie Daten laden. Wenn das Pop-up-Fenster erscheint, in dem die Kalibrierwerte für den Cantilevers angefordert werden, geben Sie die Kalibrierwerte in die entsprechenden Eingabefelder ein.
Klicken Sie auf die Schaltfläche Senden, um fortzufahren. In einem zweiten Popup-Fenster fahren Sie mit dem Ladevorgang der quantitativen Bildgebungskarte (QI) fort, indem Sie auf die Schaltfläche "Senden" klicken. Nach Abschluss des Ladevorgangs wird der anfängliche Kraftverlauf des Kraftkennfelds auf dem Bildschirm angezeigt.
Stellen Sie die Passungstiefe im entsprechenden Eingabefeld auf 1,5 Mikrometer ein und wählen Sie über Hertz fit für den Kontaktfinder-Algorithmus aus. Um die Anpassung des geänderten Hertz-Modells auf alle Krafteinrückungskurven der QI-Map anzuwenden, klicken Sie auf die Schaltfläche Auf alle anwenden beibehalten. Nach Abschluss der letzten Kraftverlaufsanalyse erscheint ein Fenster zum Speichern der Dateien.
Klicken Sie auf Ja und geben Sie einen Namen für die Ergebnisdateien ein. Für die räumliche Filterung der QI-Map aus dem Fenster Anwendungsauswahl in der CANTER Processing Toolbox wählen Sie das Ergebnisfilterwerkzeug aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Anwendung starten. Um die Einpassungsergebnisse zu laden, klicken Sie in der oberen Menüleiste der Benutzeroberfläche des Ergebnisfilterwerkzeugs auf Öffnen.
Suchen Sie im folgenden Popup-Fenster die erste Schaltfläche Festlegen auf der Registerkarte JPK Maps und wählen Sie die TSV-Datei aus, die die Ergebnisse der Kraftkurvenanalyse enthält. Klicken Sie dann auf die zweite Schaltfläche Festlegen und suchen Sie die QI-Map-Datei, die der ausgewählten TSV-Datei entspricht. Klicken Sie anschließend auf Senden, um die Kartendaten und die Ergebnisse der Kraftkurvenanalyse zu laden.
Wählen Sie im Dropdown-Menü "Angezeigter Kanal" oben die Option "EModul" aus, um die Ergebnisse des Elastizitätsmoduls als Kartenbild anzuzeigen. Wählen Sie dann im Dropdown-Menü Datenkanal unterhalb des Histogrammdiagramms die Option EModul aus, um die Verteilung der geladenen Young-Moduluswerte der QI-Karte zu visualisieren. Klicken Sie anschließend auf die Pfeilschaltfläche für den Manipulationsfluss in der Mitte der Benutzeroberfläche und stellen Sie sicher, dass er auf die rechte Seite zeigt.
Legen Sie die Umschaltschaltfläche Bildfilter auf die Position Ein im Filterbedienfeld über den Histogrammachsen fest. Wählen Sie im Dropdown-Menü "Geometrie filtern" die Option "Freihand" aus und klicken Sie dann auf die Schaltfläche "Hinzufügen". Zeichnen Sie auf dem oberen Kanalbild die Filtermaske, indem Sie die Basalmembran umkreisen, während Sie die linke Maustaste gedrückt halten.
Lassen Sie dann die Maustaste los, wenn Sie fertig sind, und doppelklicken Sie auf die Maske, um sie auf die Karte anzuwenden. Um eine neue tsv-Ergebnisdatei mit den maskierten Young-Moduluswerten zu speichern, klicken Sie in der oberen Menüleiste auf Speichern, Histogramm speichern und Daten speichern. Klicken Sie im angezeigten Popup-Fenster auf Alle auswählen, um auszuwählen, welche Ergebnisse in die tsv-Datei geschrieben werden sollen.
Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche OK, um die Auswahl zu bestätigen. Geben Sie im Dialogfeld Speichern einen Namen für die TSV-Datei ein, wählen Sie den gewünschten Speicherort aus und klicken Sie auf OK, um die gefilterten Ergebnisse zu speichern. Die Elastizitätsmodulwerte der pulmonalen Basalmembran wiesen eine logarithmische Normalverteilung mit einem Spitzenwert von 9,31 und einer Standardabweichung von 0,18 auf, was zu einem repräsentativen Elastizitätsmodul von 11,05 Kilopascal führte.
Diese Ergebnisse wurden durch ein Quantil-Quantil-Diagramm weiter bestätigt.
