私たちの研究では、細胞外マトリックスの機械的特性が細胞の挙動と組織の完全性に及ぼす影響を調査しています。私たちは、細胞とその微小環境との間の相互作用が、転移形成などの病理学的プロセスにどのように影響するかを理解したいと考えています。肺基底膜の機械的特性をデータマイニングすることにより、柔らかい基底膜ほどがん細胞の浸潤に対してより耐性があることを発見しました。
私たちのプロトコルで提示されている方法は、機械的特性を維持しながら、固定されていない生物学的サンプルの凍結切片化と機械的調査を可能にします。さらに、私たちのプロトコルで説明されている原子間力顕微鏡の測定およびフィルタリング手順により、肺胞壁の内側の基底膜のみのヤング率を決定する方法を示します。次のステップは、基底膜の剛性のダイナミクスと、発生過程および病理学的プロセスにおけるその役割についてさらに学び、診断を改善し、治療オプションを導く可能性があることです。
まず、凍結した最適切断温度(OCT)化合物のマウス肺組織を含む型を、マイナス80°Cの冷凍庫から取り出します。つや消しエッジ顕微鏡スライドの中央に両面粘着テープを置きます。15ミリリットルの遠心分離管をテープの上に転がして、気泡のないしっかりとした接着を確保します。
テープの長さが、サンプルを含む OCT ブロックの幅と一致していることを確認してください。サンプル情報とセクション番号を含む鉛筆でスライドにラベルを付けます。準備した顕微鏡スライドをスライドボックスに挿入します。
スライドボックスをクライオトームチャンバー内に置き、スライドを冷やします。次に、サンプルホルダーの内側の2つのリングにOCT媒体を充填します。サンプルホルダー上のOCT培地内にサンプルを配置します。
OCT培地が完全に固化し、サンプルがしっかりと固定されるまで、サンプルホルダーをクライオトームチャンバーに約10分間置きます。次に、サンプルホルダーをクライオトームの切断ステージに取り付けます。片面粘着テープをサンプルに貼り付けるには、冷たい親指でしっかりと押します。
クライオトームを使用して15マイクロメートルの組織切片を作成します。ブラシを使用してセクションを方向付け、切断手順中に粘着テープが剥がれるのを防ぎます。冷やした顕微鏡スライドに両面粘着テープを貼り、切片にしっかりと押し付けて持ち上げます。
セクションを運んでいるスライドをスライドボックスに戻します。熱雑音法を使用してカンチレバーを校正するには、原子間力顕微鏡(AFM)のサンプルステージに顕微鏡スライドを置きます。AFMヘッドをサンプルステージに置きます。
次に、ステッピングモーターを使用して、カンチレバーホルダーと顕微鏡スライドの間のギャップが約1〜2ミリメートルになるまでAFMヘッドを下げます。長い針付きの1ミリリットルの注射器を使用して、カンチレバーホルダーの側面にPBSを塗布し、カンチレバーホルダーが流れ落ちて隙間に流体の半月板を形成するようにします。AFM制御ソフトウェアで接触式キャリブレーションを実行するには、Acquire Dataページに移動し、Advanced Viewオプションを選択します。
キャリブレーションマネージャーにアクセスするには、右上隅にあるハンバーガーメニューボタンをクリックします。次に、方法として[コンタクトベース]を選択し、[名前]ドロップダウンメニューからカンチレバー名として[MLCT-Fカンチレバー]を選択します。[Setpoint] フィールドに 1 ボルトを入力し、[Number of scans] フィールドに 10 を入力します。
[データ集録]ページで、左側のコントロールパネルに自動アプローチ手順の設定値を1ボルト入力します。インターフェイスの左上隅にある青い下向き矢印ボタンをクリックして、自動アプローチを開始します。アプローチが完了し、カンチレバーが顕微鏡スライドに接触したら、キャリブレーションマネージャーウィンドウのキャリブレーションボタンをクリックしてキャリブレーションを開始します。
キャリブレーションが完了したら、Calibration Managerウィンドウを閉じ、決定されたキャリブレーション結果を含むキャリブレーションファイルが事前に選択したディレクトリに生成されていることを確認します。まず、切片化されたマウス肺組織を含む検体スライドを冷凍庫から取り出します。顕微鏡スライドをAFMのサンプルステージに置きます。
ユーザーインターフェースの右上隅にあるレンチアイコンのボタンをクリックして、設定マネージャーに移動します。[アプローチ設定]セクションで、[ターゲットの高さ]を4マイクロメートルに設定します。次に、[Advanced Feedback Settings] の [Current Mode Settings] セクションで、乗数を 1 に設定します。
現在のモード設定の[力の設定]サブセクションで、[モードの終了時のモード]ドロップダウンメニューから[引っ込められたピエゾ]を選択します。左側のコントロールパネルで、フォースインデントカーブのパラメータを設定します。NanoWizard 4 XPおよびMLCTカンチレバーの場合、F入力セットポイントは5ナノニュートン、Z長さは8マイクロメートル、Z速度は毎秒300マイクロメートルです。
次に、最初のオーバービューフォースマップの位置とサイズを定義して、一方の空気側からもう一方の側に伸びる歯槽壁全体を囲むようにします。ピクセル数を 50 x 50 に設定します。オーバービューマップを記録した後、基底膜上に3 x 3マイクロメートルまたは4 x 4マイクロメートルのサイズで、ピクセル数を50 x 50の曲線に保ちながら、より焦点を絞った力マップをキャプチャします。
フォース インデンテーション カーブを解析するには、MATLAB で CANTER Processing Toolbox を起動し、フォース カーブ解析アプリケーションを開きます。次に、肺セクションの高解像度力マップをロードするには、[ファイルの選択]をクリックし、保存場所に移動してファイルをダブルクリックし、[データのロード]を選択します。カンチレバーの校正値を要求するポップアップウィンドウが表示されたら、それぞれの編集フィールドに校正値を入力します。
「送信」ボタンをクリックして続行します。2番目のポップアップウィンドウで、Submitボタンをクリックして、定量的イメージング(QI)マップのロード手順を続行します。ロードプロセスが完了すると、フォースマップの初期フォースカーブが画面に表示されます。
対応する編集フィールドのフィット深さを 1.5 マイクロメートルに設定し、コンタクト ファインダ アルゴリズムで [via Hertz fit] を選択します。変更したHertzモデルのフィットをQIマップのすべてのフォースインデンテーションカーブに適用するには、Keep Apply to allボタンをクリックします。最後の力曲線解析が完了すると、ファイルを保存するためのウィンドウが表示されます。
「はい」をクリックし、結果ファイルの名前を入力します。CANTER Processing ToolboxのApplication SelectionウィンドウからQIマップの空間フィルタリングを行うには、Result Filtering Toolを選択し、Start Applicationボタンをクリックします。フィット結果を読み込むには、結果フィルタリングツールのユーザーインターフェースの上部メニューバーにある開くをクリックします。
次のポップアップウィンドウで、JPKマップタブの下にある最初のSetボタンを見つけ、力曲線解析結果を含むtsvファイルを選択します。次に、2番目の[セット]ボタンをクリックして、選択したtsvファイルに対応するQIマップファイルを見つけます。続いて、[送信]をクリックしてマップデータを読み込み、曲線解析結果をフォースします。
上部の [Displayed channel] ドロップダウン メニューから [EModul] オプションを選択し、Young 率の結果をマップ イメージとして表示します。次に、ヒストグラムプロットの下にあるデータチャネルドロップダウンメニューから、EModulオプションを選択して、QIマップのロードされたヤング率値の分布を視覚化します。次に、ユーザーインターフェイスの中央にある操作フロー矢印ボタンをクリックして、右側を指していることを確認します。
[画像フィルター] トグル ボタンを [フィルター] パネルのヒストグラム軸の上の [オン] の位置に設定します。[フィルタージオメトリ]ドロップダウンメニューから[フリーハンド]オプションを選択し、[追加]ボタンをクリックします。トップチャンネルの画像では、マウスの左ボタンを押したまま基底膜を一周してフィルターマスクを描きます。
次に、終了したらマウスボタンを放し、マスクをダブルクリックしてマップに適用します。マスクされたヤング率の値で新しいtsv結果ファイルを保存するには、上部のメニューバーで[保存]、[ヒストグラムの保存]、および[データの保存]をクリックします。表示されるポップアップウィンドウで、[すべて選択]をクリックして、tsvファイルに書き込む結果を選択します。
次に、[OK]ボタンをクリックして選択を確定します。[保存] ダイアログで tsv ファイルの名前を入力し、目的の保存場所を選択し、[OK] をクリックしてフィルター処理された結果を保存します。肺基底膜のヤング率の値は、ピーク値が9.31、標準偏差が0.18の対数正規分布を示し、代表的なヤング率が11.05キロパスカルでした。
これらの知見は、分位点-分位点プロットによってさらに確認されました。
