Nella nostra ricerca indaghiamo l'influenza delle proprietà meccaniche della matrice extracellulare sul comportamento cellulare e sull'integrità dei tessuti. Vogliamo capire come l'interazione tra le cellule e il loro microambiente influenzi processi patologici come la formazione di metastasi. Estraendo i dati dalle proprietà meccaniche della membrana basale polmonare abbiamo scoperto che le membrane basali più morbide sono più resistenti all'invasione delle cellule tumorali.
Il metodo presentato nel nostro protocollo consente la criosezione e l'indagine meccanica di campioni biologici non fissati, preservandone le proprietà meccaniche. Inoltre, mostra un modo per determinare il modulo di Young esclusivamente della membrana basale all'interno della parete alveolare mediante una misurazione al microscopio a forza atomica e procedure di filtraggio descritte nel nostro protocollo. Il passo successivo è quello di saperne di più sulle dinamiche della rigidità della membrana basale e sul suo ruolo nei processi di sviluppo e patologici per migliorare potenzialmente la diagnostica e guidare le opzioni di trattamento.
Per iniziare, rimuovere lo stampo contenente la temperatura di taglio ottimale congelata, o OCT, composto di tessuti polmonari di topo incorporati dal congelatore a meno 80 gradi Celsius. Posizionare il nastro biadesivo al centro del vetrino del microscopio con bordo smerigliato. Arrotolare una provetta da centrifuga da 15 millilitri sul nastro per garantire un'adesione salda e senza bolle.
Assicurarsi che la lunghezza del nastro corrisponda alla larghezza del blocco OCT contenente il campione. Etichettare le diapositive con una matita, includendo le informazioni sul campione e i numeri di sezione. Inserire i vetrini da microscopio preparati in una scatola per vetrini.
Posizionare la scatola dei vetrini all'interno della camera del criotomo per raffreddare i vetrini. Quindi, riempire i due anelli interni del portacampioni con terreno OCT. Posizionare il campione all'interno del mezzo OCT sul supporto del campione.
Posizionare il portacampione nella camera del criotomo per circa 10 minuti fino a quando il mezzo OCT non si solidifica completamente e il campione è saldamente fissato. Ora, installa il portacampione sulla fase di taglio del criotomo. Attaccare un pezzo di nastro adesivo unilaterale al campione premendo con decisione con un pollice freddo.
Produrre una sezione di tessuto di 15 micrometri utilizzando il criotomo. Utilizzare una spazzola per dirigere la sezione ed evitare che il nastro adesivo si stacchi durante la procedura di taglio. Utilizzare un vetrino da microscopio raffreddato con nastro biadesivo e premerlo saldamente sulla sezione per raccoglierlo.
Posizionare la diapositiva che riporta la sezione nella scatola delle diapositive. Per calibrare il cantilever utilizzando il metodo del rumore termico, posizionare un vetrino da microscopio sul tavolino del campione del microscopio a forza atomica, o AFM. Posizionare la testa AFM sul tavolino campione.
Quindi abbassare la testa AFM utilizzando i motori passo-passo fino a quando la distanza tra il supporto a sbalzo e il vetrino del microscopio è di circa uno o due millimetri. Utilizzando una siringa da un millilitro con un ago lungo, applicare PBS sul lato del supporto a sbalzo, lasciandolo fluire verso il basso e formare un menisco fluido nella fessura. Nel software di controllo AFM per eseguire una calibrazione basata sul contatto, accedere alla pagina Acquisisci dati e selezionare l'opzione Vista avanzata.
Accedi a Gestione calibrazione facendo clic sul pulsante del menu dell'hamburger situato nell'angolo in alto a destra. Quindi selezionare Basato su contatto come metodo e MLCT-F cantilever dal menu a discesa Nome come nome del cantilever. Immettere un volt nel campo Setpoint e 10 nel campo Numero di scansioni.
Nella pagina Acquisisci dati inserire un Setpoint di un volt per la procedura di avvicinamento automatico nel pannello di controllo sinistro. Fare clic sul pulsante blu della freccia rivolta verso il basso nell'angolo in alto a sinistra dell'interfaccia per avviare l'avvicinamento automatico. Quando l'avvicinamento è completo e il cantilever è a contatto con il vetrino del microscopio, fare clic sul pulsante Calibra nella finestra Gestione calibrazione per avviare la calibrazione.
Al termine della calibrazione, chiudere la finestra Gestione calibrazione e assicurarsi che nella directory preselezionata venga generato un file di calibrazione contenente i risultati di calibrazione determinati. Per iniziare, recuperare dal congelatore il vetrino contenente tessuti polmonari di topo sezionati. Posizionare il vetrino del microscopio sul tavolino campione dell'AFM.
Fare clic sul pulsante con l'icona della chiave inglese nell'angolo in alto a destra dell'interfaccia utente per accedere a Gestione impostazioni. Nella sezione Impostazioni di avvicinamento, impostare l'altezza target su quattro micrometri. Quindi, nella sezione Impostazioni modalità corrente, in Impostazioni di feedback avanzate, imposta il moltiplicatore su uno.
Nella sottosezione Impostazioni Forza delle Impostazioni Modalità Corrente, selezionare Piezo Retratto dal menu a discesa Modalità alla fine. Nel pannello di controllo a sinistra impostare i parametri per le curve di indentazione della forza. Per il NanoWizard 4 XP e l'ingresso F a sbalzo MLCT Setpoint a cinque nanonewton, lunghezza Z a otto micrometri e velocità Z a 300 micrometri al secondo.
Quindi, definisci la posizione e le dimensioni della mappa di forza panoramica iniziale per comprendere l'intera parete alveolare, che si estende da un lato dell'aria all'altro. Impostate il numero di pixel su 50 x 50. Dopo aver registrato la mappa panoramica, acquisire una mappa di forza più focalizzata con una dimensione di tre per tre micrometri o quattro per quattro micrometri sulla membrana basale, mantenendo il numero di pixel a 50 per 50 curve.
Per analizzare le curve di indentazione della forza, avviare CANTER Processing Toolbox in MATLAB e aprire l'applicazione Force Curve Analysis. Quindi, per caricare la mappa di forza ad alta risoluzione della sezione polmonare, fare clic su Seleziona file, accedere alla posizione di salvataggio, fare doppio clic sul file e selezionare Carica dati. Quando viene visualizzata la finestra pop-up che richiede i valori di calibrazione per il cantilever, inserire i valori di calibrazione nei rispettivi campi di modifica.
Fare clic sul pulsante Invia per procedere. Alla seconda finestra pop-up, continuare con la procedura di caricamento della mappa di imaging quantitativo, o QI, facendo clic sul pulsante Invia. Al termine del processo di caricamento, sullo schermo viene visualizzata la curva di forza iniziale della mappa di forza.
Impostare la profondità di adattamento nel campo di modifica corrispondente su 1,5 micrometri e selezionare tramite Hertz fit per l'algoritmo di ricerca dei contatti. Per applicare l'adattamento del modello di Hertz modificato a tutte le curve di indentazione della forza della mappa QI, fare clic sul pulsante Mantieni Applica a tutti. Dopo il completamento dell'ultima analisi della curva di forza, viene visualizzata una finestra per salvare i file.
Fare clic su Sì e immettere un nome per i file dei risultati. Per filtrare lo spazio della mappa QI dalla finestra di selezione dell'applicazione nel CANTER Processing Toolbox, selezionare lo strumento di filtraggio dei risultati e fare clic sul pulsante Avvia applicazione. Per caricare i risultati dell'adattamento, fare clic su Apri nella barra dei menu in alto dell'interfaccia utente dello strumento di filtraggio dei risultati.
Nella finestra popup successiva, individua il primo pulsante Imposta nella scheda Mappe JPK e seleziona il file tsv contenente i risultati dell'analisi della curva di forza. Quindi fare clic sul secondo pulsante Imposta e individuare il file della mappa QI corrispondente al file tsv selezionato. Successivamente, fare clic su Invia per caricare i dati della mappa e i risultati dell'analisi della curva di forza.
Dal menu a discesa Canale visualizzato in alto, selezionare l'opzione EModul per visualizzare i risultati del modulo di Young come immagine della mappa. Quindi, dal menu a discesa Canale dati sotto il grafico dell'istogramma, scegliere l'opzione EModul per visualizzare la distribuzione dei valori del modulo di Young caricati della mappa QI. Quindi, fai clic sul pulsante freccia Flusso di manipolazione al centro dell'interfaccia utente, assicurandoti che punti verso il lato destro.
Impostate l'interruttore Filtro immagine sulla posizione On nel pannello Filtro sopra gli assi dell'istogramma. Dal menu a discesa Filtra geometria, selezionare l'opzione Mano libera e quindi fare clic sul pulsante Aggiungi. Sull'immagine del canale superiore, disegna la maschera del filtro girando intorno alla membrana del basamento mentre tieni premuto il pulsante sinistro del mouse.
Al termine, rilasciare quindi il pulsante del mouse e fare doppio clic sulla maschera per applicarla alla mappa. Per salvare un nuovo file dei risultati tsv con i valori del modulo di Young mascherati, fare clic su Salva, Salva istogramma e Salva dati nella barra dei menu in alto. Nella finestra popup che appare, fai clic su Seleziona tutto per scegliere quali risultati scrivere nel file tsv.
Quindi fare clic sul pulsante OK per confermare la selezione. Nella finestra di dialogo Salva immettere un nome per il file tsv, scegliere la posizione di salvataggio desiderata e fare clic su OK per salvare i risultati filtrati. I valori del modulo di Young della membrana basale polmonare mostravano una distribuzione log normale con un valore di picco di 9,31 e una deviazione standard di 0,18, producendo un modulo di Young rappresentativo di 11,05 kilopascal.
Questi risultati sono stati ulteriormente confermati dal grafico quantile-quantile.
