胰腺导管细胞系中 pH 值改变的癌基因表达分析

在 AIG 医院，我们研究了胰管分泌物减少和 pH 值降低如何影响胰腺导管细胞中的基因表达，特别是关注癌基因，探索细胞适应酸性微环境的可能性。这里的挑战是胰腺肿瘤的异质性，这使得治疗和实验方法复杂化。因此，我们在降低 pH 值的条件下对胰腺导管细胞进行了 RNAC 分析，我们发现三种癌基因的表达增加，突出了酸性环境与胰腺导管细胞中癌基因表达之间的潜在联系。

我们的研究揭示了低 pH 条件下癌基因的表达，该系统可以推进我们在炎症条件下研究胰腺导管腺癌的研究。因此，本研究的未来范围是评估癌基因表达增加在炎症条件下（例如慢性胰腺炎）肿瘤发生中的作用。首先，采购人正常胰腺导管细胞系。

在 37 摄氏度的水浴中解冻细胞。现在通过针式过滤器过滤新鲜制备的完全培养基。将 6 mL 完全培养基加入新的 15 mL 锥形管中。

然后将解冻的细胞悬液转移到试管中并充分混合。将悬浮液以 1， 800 G 离心 6 分钟。弃去上清液，向沉淀中加入 1 毫升培养基，然后轻轻混合。

接下来，将 4 毫升完全培养基加入 60 毫米培养皿中。然后将细胞悬液滴入培养瓶中。在 37 摄氏度下在 5% 二氧化碳补充下孵育培养物。

要改变培养基的 pH 值，首先，制备 100 毫升 pH 值为 6.0、6.5 和 7.0 的 0.5 摩尔磷酸钠缓冲液。用 pH 计检查 pH 值，并使用 1 摩尔盐酸或 1 摩尔氢氧化钠进行调节。然后过滤，使用 0.45 微米注射器过滤器在层流罩中对缓冲液进行消毒。

接下来，将 20 毫升具有相应 pH 值的无菌 0.5 摩尔磷酸钠缓冲液添加到 80 毫升培养基中，以制备不同 pH 值的培养基。将 pH 值改变的培养基加入 85% 至 90% 汇合的人胰腺导管细胞中。在明场显微镜下以一小时的间隔观察形态变化，持续 6 小时。

要从培养物中分离 RNA，首先吸出培养基并用 1 毫升 PBS 冲洗细胞。将 60 毫米培养皿置于冰上，然后将 1 毫升 PBS 加入 60 毫米培养皿中，并用细胞刮刀刮擦细胞。现在将悬浮液转移到新管中。

以 8， 000 G 离心 10 分钟，然后弃去上清液。接下来，向沉淀中加入 600 μL 含有 β-巯基乙醇的裂解缓冲液。在冰上下移液 5 至 10 分钟。

向裂解物中加入等体积的 70% 乙醇，并移液悬浮液以充分混合。将溶液转移到硅胶膜柱中。然后以超过 8， 000 G 的离心力离心色谱柱 30 秒，并丢弃流出液。

接下来，向样品中加入 500 微升洗涤缓冲液并再次离心。将空管以超过 8， 000 G 的离心力离心 1 分钟，最后，向柱中加入 30 至 50 μL 不含核酸酶的水。在室温下孵育 5 分钟后，以高于 8， 000 G 的速度再次离心色谱柱 5 分钟。

与维持在正常培养基中的细胞相比，在酸性培养基中观察到细胞大小和延展性细胞收缩的显着减小。细胞死亡最明显的变化发生在孵育 6 小时后，细胞计数和 22 小时时细胞应激迹象进一步减少。上调基因的数量最高，pH 值为 6.5，有 148 个基因，其次是 pH 7，有 109 个基因，pH 值为 6，有 90 个基因。

下调基因较少，在 pH 6 时有 20 个，在 pH 6.5 时有 14 个，在 pH 7 时有 23 个。3 个癌基因、LCK、FGR 和 ASAP 3 在所有测试的 pH 值下上调，表明在酸性条件下参与细胞增殖。