En los hospitales AIG, investigamos cómo la disminución de las secreciones ductales pancreáticas y la disminución del pH afectan las expresiones génicas en las células ductales pancreáticas, centrándonos especialmente en los oncogenes, explorando la posibilidad de adaptación celular a microambientes ácidos. El reto aquí es la heterogeneidad de los tumores pancreáticos, lo que complica tanto el tratamiento como los enfoques experimentales. Por lo tanto, realizamos un análisis de RNAC de células ductales pancreáticas en condiciones de pH reducido, y descubrimos que hay una mayor expresión de tres oncogenes, lo que destaca los vínculos potenciales entre el entorno ácido y la expresión de oncogenes en las células ductales pancreáticas.
Nuestro estudio ha arrojado luz sobre la expresión del oncogén en condiciones de pH reducido, y este sistema puede avanzar en nuestra investigación en el estudio del adenocarcinoma ductal de páncreas en condiciones de inflamación. Por lo tanto, el alcance futuro de este estudio es evaluar el papel del aumento de la expresión de oncogenes en los inicios de tumores en condiciones inflamatorias, como en la pancreatitis crónica. Para comenzar, obtenga la línea celular ductal pancreática normal humana.
Descongele las células a 37 grados centígrados en un baño de agua. Ahora filtre el medio completo recién preparado a través de un filtro de jeringa. Agregue seis mililitros de medio completo a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros.
A continuación, transfiera la suspensión de células descongeladas al tubo y mezcle bien. Centrifugar la suspensión a 1.800 g durante seis minutos. Deseche el sobrenadante y agregue un mililitro de medio de cultivo al pellet antes de mezclar suavemente.
A continuación, agregue cuatro mililitros de medio completo en una placa de Petri de 60 milímetros. A continuación, pipetee la suspensión de la célula gota a gota en el matraz. Incubar el cultivo a 37 grados centígrados bajo un 5% de suplementación de dióxido de carbono.
Para cambiar el pH del medio de cultivo, primero prepare 100 mililitros de soluciones tampón de fosfato de sodio 0,5 molar con valores de pH de 6,0, 6,5 y 7,0. Verifique el pH con un medidor de pH y ajústelo con un ácido clorhídrico molar o un hidróxido de sodio molar. A continuación, filtre y esterilice los tampones en una campana de flujo de aire laminar utilizando un filtro de jeringa de 0,45 micrómetros.
A continuación, agregue 20 mililitros de tampón estéril de fosfato de sodio 0,5 molar del pH respectivo a 80 mililitros de medio de cultivo para preparar medios de pH diferente. Agregue el medio con el pH alterado a 85 a 90% de células ductales pancreáticas humanas confluentes. Observe los cambios morfológicos bajo un microscopio de campo claro a intervalos de una hora durante seis horas.
Para aislar el ARN del cultivo, primero aspire el medio de cultivo y enjuague las células con un mililitro de PBS. Coloque el plato de 60 milímetros en hielo, luego un mililitro de PBS en el plato de 60 milímetros y raspe las celdas con un raspador de celdas. Ahora transfiera la suspensión a un tubo nuevo.
Centrifugar a 8.000 g durante 10 minutos y desechar el sobrenadante. A continuación, agregue 600 microlitros de tampón de lisis que contiene beta-mercaptoetanol al pellet. Pipetea la suspensión hacia arriba y hacia abajo durante cinco a 10 minutos sobre hielo.
Agregue un volumen igual de 70% de etanol al lisado y pipetee la suspensión para mezclar bien. Transfiera la solución a una columna de membrana de sílice. A continuación, centrifugar la columna a más de 8.000 G durante 30 segundos y desechar el flujo.
A continuación, añada 500 microlitros de tampón de lavado a la muestra y vuelva a centrifugar. Centrifugar el tubo vacío durante un minuto a más de 8.000 G.Por último, añadir de 30 a 50 microlitros de agua libre de nucleasas a la columna. Después de una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente, vuelva a centrifugar la columna a velocidades superiores a 8.000 G durante cinco minutos.
Se observó una reducción significativa en el tamaño de las células y una contracción de las células dúctiles en medio ácido en comparación con las células mantenidas en un medio normal. Los cambios más pronunciados en la muerte celular ocurrieron después de seis horas de incubación, con una disminución adicional en el recuento de células y signos de estrés celular a las 22 horas. El número de genes regulados al alza fue más alto a pH 6,5 con 148 genes, seguido de pH siete con 109 genes y pH seis con 90 genes.
Los genes regulados a la baja fueron menos, con 20 a pH seis, 14 a pH 6,5 y 23 a pH siete. Tres oncogén, LCK, FGR y ASAP tres se regularon al alza en todos los niveles de pH probados, lo que sugiere un papel en la proliferación celular en condiciones ácidas.
