三维细胞培养中胰腺肌囊内增生的模拟与操纵

我们的协议提供阿西纳到电图代谢的直接可视化，并允许研究异位管理因子或蛋白质调制对这个过程的贡献。该技术的主要优点是，可实时查看阿西纳到电感代谢，并可进行细胞信号研究。要解剖安乐死小鼠的胰腺，首先将小鼠的爪子固定在聚苯乙烯盖上，将其定向，使尾巴面向研究人员，用70%乙醇喷洒腹部。

使用自 <3>化钳在中线抬起毛皮和皮肤，并使用自动剪剪刀，通过毛皮和皮肤从尿道开口到隔膜肋笼区域进行切口。在左侧和右侧进行额外的切口，切开毛皮和皮肤，从而清晰地查看腹腔。然后，切入内膜衬里，下到中间，到左右，把它从器官拉开。

使用钳子抬起肠子并将其移到鼠标的左侧，从而创建空间，查看连接到深色、红色、椭圆形脾脏的浅粉色胰腺。胰腺组织将有柔软的海绵状纹理。切掉沿着胃跑的胰腺，与肠子交织在一起。

将脾脏与胰腺分离，将胰腺放在含有 10 毫升 HBSS 的 50 毫升管中，用 1 倍青霉素链霉素将其转移到层流罩中。将管子内的东西倒入空的称重船上，用钳子用旋涡清洗胰腺。然后，使用钳子将胰腺移动到含有青霉素链霉素的 HBSS 的第二艘称重船上，然后通过旋转再次清洗。

将胰腺移动到含有HBSSS的第三艘称重船，并用青霉素链霉素将胰腺切成5毫米或更小的碎片。要将称重船的内容倒入一个新的50毫升管中，首先使用钳子将胰腺碎片移入液体中，因为船正在倾斜。一旦碎片不再附着在船上，就将其内装物倒入管子中。

用钳子拾起剩余的碎片，并清洗管子中的钳子。在4摄氏度的931倍重力下离心管2分钟后，使用5毫升移液器去除HSS和任何漂浮的脂肪。加入五毫升在HSSS中稀释的胶原酶。

将管子包装在塑料石蜡薄膜中，以密封的盖子，确保密封的盖子。放在孵化器中，在 37 摄氏度的 220 RPM 下摇晃 20 分钟。这将产生浑浊溶液，和少数剩余的组织片断。

为了停止分离，将管子放在冰上，加入5毫升的冷HBVS与5%FBS。在 4 摄氏度的 931 倍重力下离心两分钟后，使用 5 毫升移液器去除上流液。用 5%FBS 将颗粒重新悬浮在 10 毫升 HBSS 中，并在 4 摄氏度下以 931 倍重力再次离心两分钟。

使用 5 毫升移液器取出上流液，然后用 5%FBS 的另外 10 毫升 HBSS 重复此步骤。然后用5%FBS将颗粒重新悬浮在五毫升的HSS中。使用 P1000 移液器通过 500 微米的网状物一次过滤一毫升细胞悬浮液，并放入 50 毫升管中。

要通过网格清洗剩余的胰腺细胞，请添加额外的五毫升 HBSS 与 5%FBS。然后使用 P1000 移液器，通过 105 微米网格一次将一毫升滤液传递到 50 毫升管中。轻轻移液该细胞悬浮液到含有 HBSS 的 50 毫升管中，其 FBS 为 30%FBS，在顶部形成一层细胞悬浮液。

在4摄氏度下将该电池悬浮液在233倍的重力下离心两分钟，然后取出上一代。在 Waymouth 的完整介质中重新悬浮含有 Acinar 细胞的颗粒。由于一个胰腺足以进行两种病毒感染，因此在两个35毫米板的盖子之间分离细胞悬浮液，从而允许在悬浮液中感染。

对于腺病毒感染，将病毒以1/1000稀释添加到每个板的盖子和漩涡。将板放在37摄氏度和5%CO2的细胞培养箱中。第一小时每15分钟旋转一次，再持续两个小时。

要制作胶原蛋白凝胶，将7毫升1型鼠尾胶原蛋白、700微升10倍于韦茅斯的介质和466.6微升的0.34摩尔氢氧化钠在50毫升的冰上管中，制作胶原蛋白凝胶。在50毫升管中，在三个小时的孵育和轻轻混合后，将等量的细胞悬浮液和胶原蛋白凝胶混合。板2000微升，一次一个井在六井板，同时保持板在冰上和漩涡均匀分布胶原蛋白细胞层。

为了凝固培养基，在37摄氏度的细胞培养箱中孵育细胞培养箱，在30分钟内孵育5%的二氧化碳。然后添加1.5毫升每井1倍的威茅斯的完整介质与所需的刺激或抑制剂。第二天更改介质，然后每隔一天更改一次。

根据使用的刺激，可观察到第三天至第五天之间的阿西纳到管道代谢或 ADM。感染GP腺病毒后24小时，胶原蛋白或基底膜基质中嵌入的细胞图像显示感染是有效的。在感染后五天，在胶原蛋白中嵌入的细胞在每毫升TGFα的50毫微克刺激下形成管道样结构。

嵌入在地下室膜基质中的细胞在感染后五天没有刺激的情况下形成管道样结构。而较大的管道是在刺激后形成的，每毫升TGFα为50毫微克。协议中最关键的一点是胶原酶消化的长度。

适当的消化由浊溶液和少数剩余的组织片段指示。