Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt ein neuartiges Protokoll und Reagenz-Set für empfindliche Messung der neurotoxischen Wirkungen von Verbindungen und Behandlungen auf Co-Kulturen von Neuronen und Astrozyten mit High Content Analyse entwickelt. Die Ergebnisse zeigen, dass High Content Analyse eine spannende neue Technologie für die Neurotoxizität Beurteilung darstellt.

Zusammenfassung

High Content Analyse (HCA)-Assays kombinieren Zellen und Nachweisreagenzien mit Automated Imaging und leistungsfähige Bildanalyse-Algorithmen, so dass die Messung von mehreren zellulären Phänotypen in einem einzigen Assay. In dieser Studie verwendeten wir HCA eine neuartige Assays für Neurotoxizität zu entwickeln. Neurotoxicity Bewertung stellt einen wichtigen Teil der Bewertung der Arzneimittelsicherheit, wie auch als ein wichtiger Schwerpunkt der Bemühungen im Umweltschutz. Darüber hinaus ist Neurotoxizität auch ein gut angenommen

Protokoll

Cell Preparation:

1. Vor Zellaussaat für Test-, Kultur-Neuronen / Astrozyten in Nährmedien bis ~ 70-80% konfluent (es sei denn, Zellaussaat direkt vom Tauwetter oder Isolation).
2. Lösen Sie Zellen aus Kulturflaschen / Platten über geeignete Methode für Zelltyp von Interesse. Wenn nötig, zu beschichten Assayplatte Brunnen mit Poly-D-Lysin oder extrazellulären Matrix-Proteins zu verbessern Zelladhäsion. Co-Kulturen von Astrozyten und Neuronen können gleichzeitig oder nacheinander ausgesät werden. Für die sequentiellen Setzliste ist plating von Astrozyten zunächst als "basal" Schicht empfohlen, gefolgt von neuronalen Beschichtung und Differenzierung, wenn nötig. Passen Zelldichte gegebenenfalls für die Zell-Typ, nachfolgende Kultur der Zeit, Parameter von Interesse, etc. Je nach Kultur Alters-, Zell-Quelle und Aussaatdichte, können primäre Kulturen sehr unterschiedlich in Proliferationsrate, GFAP Ausdruck oder Neuritenwachstum - ist es wichtig, charakterisieren und optimieren Sie Ihre Zellsystem zu den biologischen Relevanz für Ihre experimentellen Modell, als auch für eine effektive Bildverarbeitung, Segmentierung und Analyse mit HCS (siehe Abbildung 1) bereitzustellen. Nach Hinzufügen von Zellen zu Platte (Zellen können in 90 ul Medien ausgesät werden, um Toxin-Behandlung zu erleichtern, wie in Schritt 3 beschrieben), ermöglichen Platte auf einer ebenen Fläche bei Raumtemperatur stehen lassen für 15-30 min, so dass auch Zellverteilung. Nach dieser Zeit inkubieren Zellen in Wachstumsmedium (37 ° C / 5% CO ₂₎ für mindestens 24 Stunden, dann die Differenzierung Kulturbedingungen Schalter (zB niedrige Serum / NGF für PC12-Zellen), als angemessen. Weiter Kultur, bis die Zellen gewünschte Zusammenfluss oder Differenzierung zu erreichen, wechselnden Medien angemessenen Abständen Zelltyp.
3. Zell-Therapien (Kontrolle Verbindungen, Testverbindungen, etc.) können an jedem Punkt in dieser Kultur Frist eingeführt werden, je nach Zeit-Verlauf der Behandlung von Interesse. Acrylamid, Wasserstoffperoxid und K-252a als neurotoxische Kontrolle Verbindungen zur Verfügung gestellt. Ausreichende Reagenzien sind für die doppelte 12-Punkte-Dosis-Wirkungs-Kurven (einschließlich eines dH ₂ O oder DMSO-Kontrolle gesetzt innerhalb der Dosis-Wirkungs-) für alle fünf 96-Well-Platten zur Verfügung gestellt. Die Verbindungen sind bei 250X-Konzentration (für K-252a, der Annahme einer maximalen Behandlung von 1 nM) oder 10X (für Acrylamid und Wasserstoffperoxid von einer maximalen Behandlungen von 100 mM und 10 mM bzw.) zur Verfügung gestellt. Empfohlene Behandlung Vorbereitung umfasst Halb-log (1: √ 10) Verdünnungsreihe des 250X Verbindung in DMSO, durch Verdünnung in Verbindung Verdünnungspuffer zu folgen 10X (10X Kontrolle Verbindungen mit Ursprung in dH ₂ O kann seriell verdünnt direkt in sterile dH ₂ O oder Compound Verdünnungspuffer). 10 ul jeder Behandlung kann dann die 90 ul von Kulturmedien bereits in jede Vertiefung gegeben werden, für eine endgültige 1X-Konzentration (0,4% DMSO oder 10% dH ₂ O). Sample-Daten ist für 24 oder 96 Stunden der Verbindung der Behandlung bei 37 ° C vor der Fixierung zur Verfügung gestellt.

Zellfixierung und Immunfluoreszenzfärbung:

Hinweis: Die Färbung beträgt ~ 2,5 Stunden nach der Fixierung. Nicht in die Brunnen austrocknen zwischen Färbeschritte. Aspiration und Dispensation von Reagenzien sollten bei niedrigen Strömungsgeschwindigkeiten durchgeführt werden, um eine beliebige Zelle Verlust durch Fluidscherung verringern. Alle empfohlenen "pro Well 'Volumina beziehen sich auf einen einzigen Vertiefung einer 96-well Mikroplatten. Alle empfohlenen "pro 96-Well-Platte 'Bände enthalten 25% Selbstbeteiligung für Liquid-Handling-Volumen Verlust. Alle Färbung Schritte sind bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt. Alle Puffer und Antikörper-Lösungen sind für mindestens 24 Stunden bei RT stabil.

4. Am Ende der Kulturzeit, pre-warm HCS Fixation Solution (2X) auf Raumtemperatur (RT) oder 37 º C, falls gewünscht (12 mL/96-well Platte). In einem Laborabzug, 100 l / well direkt auf Nährböden und lassen Sie sie für 30 min bei RT fixieren. Entfernen Fixativ / Toxin-haltigen Medien und entsorgen unter Einhaltung von Vorschriften für gefährliche Abfälle (siehe Sicherheitsdatenblatt). Wenn Sie fortfahren sofort Färbung, die jeweils gut ausspülen zweimal mit 200 ul der HCS Immunfluoreszenz Buffer. Alternativ, wenn die Platten zu einem späteren Zeitpunkt gebeizt werden, zweimal gründlich mit 200 ul Waschpuffer, dann lassen Sie zweiten Spülung Volumen in Brunnen und speichern Platten dicht bei 4 º C bis Färbung versiegelt.
5. Wenn festen Proben bei 4 º C vor dem Färben gespeichert wurden, zweimal gründlich mit 200 ul HCS Immunfluoreszenz Buffer, bevor Sie mit Färbeprotokoll.
6. Bereiten Sie arbeiten Lösung von Kaninchen Anti-βIII Tubulin / Mouse Anti-GFAP HCS Primärantikörper (6 mL/96-well Platte) wie folgt: Fügen Sie 60 ul jeder aufgetaut Primärantikörper bis 5,88 ml HCS Immunfluoreszenz Buffer. Gut mischen. Entfernen Sie ältere Immunfluoreszenz Buffer spülen. Dann werden 50 ul der Primary Antibody-Lösung in jede Vertiefung und inkubieren für 1 Stunde bei RT.
7. Entfernen des primären AntikörpersLösung. Spülen Sie dreimal mit 200 ul HCS Immunfluoreszenz Buffer.
8. Bereiten Sie arbeiten Lösung von HCS Sekundäre Antikörper / Hoechst HCS Kernfärbung (6 mL/96-well Platte) wie folgt: Fügen Sie 30 ul jeder aufgetaut sekundären Antikörper und 30 ul aufgetauten Hoechst HCS Kernfärbung zu 5,91 ml HCS Immunfluoreszenz Buffer. Gut mischen, Schutz-Lösung von Licht. Entfernen Sie ältere HCS Immunfluoreszenz Buffer spülen. Dann werden 50 ul der HCS Sekundäre Antikörper / Hoechst HCS Nuclear Stain-Lösung und Inkubation für 1 Stunde bei RT vor Licht geschützt.
9. Entfernen HCS Sekundäre Antikörper / Hoechst HCS Kernfärbung Lösung. Spülen Sie zweimal mit 200 ul HCS Immunfluoreszenz Buffer.
10. Entfernen Sie ältere HCS Immunfluoreszenz Buffer spülen. Spülen Sie zweimal mit 200 ul der HCS Waschpuffer, verlassen zweiten Spülung Volumen in Brunnen.
11. Seal Platte und Bild sofort oder zu speichern Platte bei 4 º C vor Licht, bis sie zur Bildgebung geschützt.

Image Acquisition and Analysis:

12. Imaging und Analyse von gefärbten Platten können von einer Vielzahl von verfügbaren HCS-Plattformen, einschließlich der IN Cell Analyzer (GE Healthcare), ArrayScan (ThermoFisher Scientific) oder Opera (Perkin Elmer) durchgeführt werden. Einige Leitlinien für die Bildgebung und Analyse sind in Tabelle 1 angegeben:

HCS222 Image Acquisition Richtlinien
Nachweisreagenz	Objektivdurchmesser	Anregungsfilter Range [peak / Bandbreite (nm)]	Emission Filter Range [peak / Bandbreite (nm)]
Hoechst HCS Kernfärbung	20X	360/40	460/40 (oder 535/50 falls erforderlich)
HCS Sekundäre Antikörper, FITC-Donkey anti-Rabbit IgG	20X	480/40	535/50
HCS Sekundäre Antikörper, Cy3-Donkey anti-Mouse IgG	20X	535/50	600/50

HCS222 Image Analysis Richtlinien
Zellparameter	Erkennung	Segmentation / Measurement	Gründe
Zellzahl, Nuclear Eigenschaften	Hoechst HCS Kernfärbung	Nuclear Region (460 nm-Emission-Kanal). Count Anzahl der Kerne. DNA-Gehalt (nuclear Intensität) oder nuklearen Bereich Analysen sind ebenfalls möglich.	Verwenden Sie Zellzahl, nukleare Eigenschaften Zellverlust, Toxizität Phänotypen, etc. bestimmen kann "Filter" Kerne für Menschen mit βIII-Tubulin oder GFAP Expression assoziiert zu trennen neuronalen und astrozytären Zellzahlen / Charakterisierungen (dringend empfohlen) zu erhalten.
βIII-Tubulin Expression, Neuritenwachstum	HCS Sekundäre Antikörper, FITC-konjugierten	Cytoplasmatische Region (535 nm-Emission-Kanal). FITC-Signal kann verwendet werden, um neuronale Zellkörper von Neuriten (zB via Minimum / Durchschnitt Zellkörper Bereichen, Minimum / Maximum Neuriten Längen und Breiten) zu unterscheiden. Bestimmen Sie Parameter wie insgesamt Neuritenlänge, Neuriten counts / Zelle, etc.	Neuritenwachstum Messungen können während der neuronalen Differenzierung oder als Folge von chemischen Verletzungen, Erkrankungen, etc. moduliert Kann "filtern" Zellkörper für Menschen mit βIII-Tubulin-Expression assoziiert zu verschiedenen neuronalen Charakterisierung (dringend empfohlen) zu erhalten.
GFAP Expression, Astrocyte Bereich	HCS Sekundäre Antikörper, Cy3-konjugierten	Cytoplasmatische Region (600 nm-Emission-Kanal). Cy3-Signal kann verwendet werden, um astrozytären zytoplasmatische Segmentierung zu definieren. Bestimmen Sie Parameter wie mittlere zytoplasmatische Signalintensität, Zellfläche, etc.	GFAP Expression und Astrozyten Zellfläche kann während Astrozyten Entwicklung oder als Folge von chemischen Verletzungen, Erkrankungen moduliert, etc. Kann "filtern" Zellkörper für die mit GFAP-Expression assoziiert zu deutlichen astrozytären Charakterisierung (dringend empfohlen) zu erhalten.

. Tabelle 1 Image Acquisition and Analysis Guidelines - HCS222 βIII-Tubulin/GFAP (Co-Kultur) Assay

Repräsentative Ergebnisse:

Abbildung 1. βIII-Tubulin und GFAP immunofluoreScence gemischter Ratte neuronalen Zellkulturen.

Co-Kulturen von primären Ratten-Hippocampus Astrozyten entweder mit primären Ratten-Neuronen im Hippocampus oder Ratte PC12 Zellen wurden durch Vor-Vernickelung Astrozyten für mehrere Tage in Kultur, durch neuronale Aussaat folgte generiert. Primäre Neuronen wurden für weitere 11 Tage kultiviert, während PC12s für weitere 2 Tage unter Differenzierung Bedingungen (niedrige Serum / NGF) kultiviert wurden. Handhabung von Zellen, Fixierung und Immunfärbung wurden nach HCS222 Assayprotokolle durchgeführt. Die Zellen wurden auf der GE IN Cell Analyzer 1000 (3.3) bei 20-fach (primären Neuronen) oder 10X (PC12) Objektivvergrößerung abgebildet und analysiert werden mit dem GE IN Cell Analyzer 1000 Workstation (3,4) Neuritenwachstum und Multi Target-Analyse-Algorithmen Top-Panel.: Fused Bilder von Hoechst HCS Kernfärbung (blau), βIII-Tubulin (grün) und GFAP (rot) Fluoreszenz. Eine getrennte Analyse der βIII-Tubulin-Fluoreszenz-Kanal ermöglicht Neuritenwachstum Segmentierung (mittlere Tafel: Zellkörper in blau (primären Neuronen beschrieben) oder gelb (PC12), Neuriten in grün (primären Neuronen) oder hellblau (PC12)). Die Analyse der GFAP-Kanal ermöglicht Astrozyten Segmentierung (unten: Kerne in blau, Zytoplasma in grün dargestellt). GFAP-Segmentierung für die primären Ratten-Hippocampus Neuronen / Astrozyten Co-Kultur zeigt die Fähigkeit, zwischen den Kernen / Zellkörper, dass GFAP (+) (Grün Umrisse) und diejenigen, die GFAP sind zu unterscheiden (-) (rot), so dass getrennte Zellzahlen für Neuronen und Astrozyten in einer Mischkultur Einstellung.



Abbildung 2. Dose Reaktionen der primären Ratten-Hippocampus Neuronen / Astrozyten Co-Kulturen zu toxischen Belastungen.

Primäre Ratten-Hippocampus Astrozyten (P6) wurden auf 96-Well-Platten in Nährmedien ausgestrichen und kultiviert für 6 Tage. Primäre Ratten-Neuronen im Hippocampus (direkt von Tauwetter) wurden dann auf der Oberseite der zuvor abgeschiedenen Astrozyten ausgesät und kultiviert in Nährmedien für 11 Tage. Die Zellen wurden mit seriellen Verdünnungen von Acrylamid oder Wasserstoffperoxid (max. Konzentration = 100mm und 10mm bezeichnet) für die letzten 24 Stunden der Kultur behandelt. Handhabung von Zellen, Fixierung und Immunfärbung wurden nach HCS222 Assayprotokolle durchgeführt. Die Zellen wurden auf der GE IN Cell Analyzer 1000 (3.3) bei 20X (10 Felder / well) abgebildet und analysiert (nuklearen / cytoplasmatischen / Neuriten Segmentierung) mit der GE IN Cell Analyzer 1000 Workstation (3,4) Neuritenwachstum und Multi Target-Analyse-Algorithmen. Die vorgelegten Daten sind Mittelwert ± SEM, n = 3. Mehrere Parameter (Neuritenwachstum, GFAP Intensität, Astrozyten und neuronalen Bereich oder astrozytären Zellzahl) wurden für eine dosisabhängige Trends untersucht.

Diskussion

Bis heute wurden in vitro Experimente zur Neurotoxizität Risikobewertung mit gemischten Kulturen von Neuronen und Astrozyten Studie beschränkt. Es ist gut angenommen, dass Gliazellen integraler bei der Bereitstellung von Raum-und Stoffwechsel-Unterstützung Neuronen sind, und spielen eine entscheidende Rolle bei der Modulation der neuronalen mehrere Funktionen, einschließlich neuronalen Migration, Differenzierung und synaptische Aktivität. Gliazellen Astrozyten auch setzen Zytokine und andere lösliche Faktoren, die in der Lage sowohl induzieren unerwünschten Reaktionen in der Umgebung neuronales Gewebe, sowie die Förderung der neuronalen Toleranz vieler Giftstoffe. Demonstration der Tiefe des neuronal-glialen Interaktionen, in Co-Kultur-Studien haben gezeigt, dass Astrozyten Neuronen gegen die Toxizität von oxidativem Stress zu schützen, während Beeinträchtigung der Astrozyten-Funktionen, wie die Instandhaltung von antioxidativen Abwehr und zellulären Energie, hat sich gezeigt, entscheidend beeinflussen neuronale Überleben. Neuere Studien legen nahe, dass die Verwendung von Astrozyten in einem in vitro Neurotoxizität Testsystem kann sich als relevant für die menschliche Zentralnervensystem Struktur und Funktion neuronaler Zellen als allein. Trotz des wachsenden Bewusstseins über die physiologische Bedeutung der neuronalen-astrozytären Interaktionen, ist es bislang schwierig, quantitative Analysen dieser Interaktionen in intakten Zellen durchzuführen. Das Aufkommen von High Content Screening ermöglicht die Entwicklung von leistungsstarken neuen Assays an diese Adresse.

In dieser Studie haben wir gezeigt, dass quantitative Analysen von mehreren neuronalen und astrozytären Phänotypen in einem einzigen Assay ermöglicht werden, indem HCA. In primären Neuronen haben wir quantitative Messungen der Neurotoxizität Marker wie neuronale Zahl, Neuriten zählen und Neuritenlänge durchgeführt. In Astrozyten, ist reaktive Gliose einen bekannten Biomarker für Neurotoxizität, durch Veränderungen in GFAP-Expression, Astrozyten Anzahl und Astrozyten Morphologie charakterisiert. Wir haben gezeigt, dass jeder von diesen Endpunkten ohne weiteres über HCA beurteilt werden. Diese Studien unterstützen das Konzept, dass HCA von neural-spezifischen Biomarkern als Teil einer Batterie konnte in vitro-Tests verwendet werden, um schnell Bildschirm eine große Anzahl von Chemikalien für die neurotoxischen Endpunkte.

Millipore ist HCS222 High Content Analyse-Kit für Co-Kultur von Neuronen und Astrozyten ist aus hochwertigem Nachweisreagenzien und Protokolle für die gleichzeitige Profilierung βIII-Tubulin und sauren Gliafaserproteins (GFAP) in einer Vielzahl von zellulären Modellen der Neurotoxizität zusammen. Die hoch-validierte Reagenzien dieses Kits erlauben dem Benutzer, Tests zu standardisieren, zu minimieren Assay-to-Assay-Variabilität und reproduzierbar zu erzeugen Bilder mit einem hohen Signal-zu-Untergrund-Verhältnis.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rabbit Anti-βIII-Tubulin HCS Primary Antibody, 100X		Part No. CS201672	1 vial containing 300 μL Millipore HCS222 Kit Component
HCS Secondary Antibody (donkey anti-rabbit IgG, FITC conjugate), 200X		Part No. CS201649	1 vial containing 150 μL Millipore HCS222 Kit Component
Mouse Anti-GFAP HCS Primary Antibody, 100X		Part No. CS201671	1 vial containing 300 μL Millipore HCS222 Kit Component
HCS Secondary Antibody (donkey anti-mouse IgG, Cy3 conjugate), 200X		Part No. CS200437	1 vial containing 150 μL Millipore HCS222 Kit Component
H–chst HCS Nuclear Stain, 200X		Part No. CS200438	1 vial containing 150 μL Millipore HCS222 Kit Component
HCS Fixation Solution with Phenol Red, 2X		Part No. CS200434	1 bottle containing 100 mL Millipore HCS222 Kit Component
HCS Immunofluorescence Buffer, 1X		Part No. CS200435	1 bottle containing 1000 mL Millipore HCS222 Kit Component
HCS Wash Buffer, 1X		Part No. 2007643	1 bottle containing 500 mL Millipore HCS222 Kit Components
Acrylamide (Control Compound), 10X		Part No. CS201679	1 vial containing 500 μL of 1M acrylamide in dH2O Millipore HCS222 Kit Component
Hydrogen Peroxide (Control Compound), 10X		Part No. CS201730	1 vial containing 500 μL of 100 mM hydrogen peroxide in dH2O Millipore HCS222 Kit Components
K-252a (Control Compound), 250X		Part No. CS201741	1 vial containing 100 μL of 250 μM K-252a in DMSO Millipore HCS222 Kit Component
DMSO for Compound Serial Dilution		Part No. CS200441	1 bottle containing 10 mL Millipore HCS222 Kit Component
Compound Dilution Buffer		Part No. CS200442	1 bottle containing 25 mL Millipore HCS222 Kit Component
Plate Sealers		Part No. CS200443	10 each Millipore HCS222 Kit Components
tissue culture-treated black/clear bottom microplates
HCS imaging/analysis system