Un neuronale e astrociti Co-Cultura Assay per l'analisi dei contenuti elevati di neurotossicità

Riepilogo

Questo articolo descrive un nuovo protocollo e reagenti impostare progettato per la misura sensibile degli effetti neurotossici di composti e trattamenti sulla co-culture di neuroni e astrociti utilizzando l'analisi ad alto contenuto. Risultati dimostrano che l'analisi ad alto contenuto rappresenta una tecnologia entusiasmante romanzo per la valutazione neurotossicità.

Abstract

Alta Content Analysis (HCA) saggi combinano le cellule e reagenti di rilevamento automatico e con immagini potenti algoritmi di analisi delle immagini, consente la misurazione di diversi fenotipi cellulari all'interno di un singolo test. In questo studio, abbiamo utilizzato HCA per sviluppare un nuovo metodo di analisi di neurotossicità. Neurotossicità di valutazione rappresenta una parte importante della valutazione sulla sicurezza dei farmaci, oltre ad essere un focus significativo degli sforzi di protezione ambientale. Inoltre, la neurotossicità è anche ben accettato

Protocollo

Preparazione delle cellule:

1. Prima della semina delle cellule per i neuroni cultura saggio, / astrociti in terreni di crescita fino a ~ confluente 70-80% (a meno che la semina di cellule direttamente dal disgelo o isolamento).
2. Staccare le cellule da fiaschi cultura / piastre tramite metodo appropriato per il tipo di cellule di interesse. Se necessario, cappotto pozzetti piastra con poli-D-lisina o di proteine ​​della matrice extracellulare per migliorare l'adesione delle cellule. Co-colture di astrociti e neuroni possono essere seminate contemporaneamente o in sequenza. Per le teste di serie sequenziali, placcatura di astrociti prima come livello "basale" è consigliato, seguito da placcatura neuronale e la differenziazione, se necessario. Regolare la densità cellulare come appropriato per il tipo di cellule, il tempo della cultura successiva, i parametri di interesse, ecc A seconda dell'età della cultura, fonte di cellule e la densità di semina, colture primarie possono variare notevolmente in velocità di proliferazione, espressione di GFAP o crescita dei neuriti - è importante caratterizzare e ottimizzare il sistema cellulare ea garantire la rilevanza biologica per il modello sperimentale, così come per fornire efficaci per l'imaging, la segmentazione e l'analisi utilizzando HCS (vedi Figura 1). Dopo aver aggiunto le cellule a piastra (cellule possono essere seminate in 90 microlitri mezzi di comunicazione, di semplificare il trattamento tossina come descritto nel passaggio 3 di seguito), permettono di sedere piatto su una superficie piana a temperatura ambiente per 15-30 minuti, consentendo una distribuzione uniforme delle celle. Dopo questo periodo, le cellule incubare in terreni di coltura (37 ° C / 5% CO ₂₎ per almeno 24 ore, quindi passare a condizioni di coltura differenziazione (per esempio, bassi livelli sierici / NGF per cellule PC12), a seconda dei casi. Continuare la cultura fino cellule raggiungere il livello desiderato di confluenza o di differenziazione, la sostituzione del supporto ad intervalli appropriati per il tipo di cellule.
3. Trattamenti con le cellule (composti di controllo, composti di prova, ecc) può essere introdotto in qualsiasi momento durante questo periodo la cultura, come appropriato per il tempo-ciclo di trattamento di interesse. Acrilamide, perossido di idrogeno e K-252bis sono forniti come composti controllo neurotossici. Reagenti siano sufficienti per le curve di duplicare la dose di 12 punti risposta (di cui uno dH ₂ O o DMSO-control trova all'interno del dose-risposta) per tutte e cinque le piastre a 96 pozzetti. I composti sono forniti concentrazione 250X (per K-252bis, assumendo una terapia massima di 1 microM) o 10X (di acrilamide e perossido di idrogeno, assumendo trattamenti massima di 100 mm e 10 mm, rispettivamente). Preparazione trattamento raccomandato coinvolge mezza log (1: √ 10) diluizione seriale del composto 250X in DMSO, seguita da diluizione in tampone di diluizione Compound a 10 volte (10 volte composti controllo originari dH ₂ O può essere diluito in serie direttamente in sterili dH ₂ O o di diluizione Compound). 10 L di ogni trattamento può poi essere aggiunto al 90 microlitri di terreni di coltura già presenti in ciascun pozzetto, per una concentrazione finale 1X (0,4% o al 10% DMSO dH ₂ O). Dati di esempio viene fornito per 24 o 96 ore di trattamento composto a 37 ° C prima della fissazione.

Fissazione e colorazione delle cellule immunofluorescenza:

Nota: il tempo di colorazione è ~ 2,5 ore dopo la fissazione. Non permettere pozzetti si asciughino tra i passaggi colorazione. Aspirazione e dispensazione dei reagenti deve essere condotta a basse portate a diminuire la perdita di cellule dovuta al taglio del fluido. Tutti raccomandati 'per bene' i volumi si riferiscono a un singolo pozzetto di una micropiastra a 96 pozzetti. Tutti raccomandati 'per 96 pozzetti' volumi includono il 25% la perdita di liquido in eccesso di volume di movimentazione. Tutte le fasi di colorazione vengono eseguite a temperatura ambiente (RT). Tutti i tamponi e le soluzioni di anticorpi sono stabili per almeno 24 ore a temperatura ambiente.

4. Alla fine del periodo di coltura, pre-riscaldare Soluzione Fissazione HCS (2X) a temperatura ambiente (RT) o di 37 º C se lo si desidera (12 piastra mL/96-well). In una cappa, aggiungere 100 l / pozzetto direttamente ai terreni di coltura e consentono di fissare per 30 minuti a RT. Rimuovere fissativo / tossina contenenti i media e smaltire in conformità alle norme per i rifiuti pericolosi (vedi scheda di sicurezza). Se procedere immediatamente alle macchie, lavare ogni pozzetto due volte con 200 ml di tampone HCS immunofluorescenza. In alternativa, se le targhe devono essere colorati in un secondo momento, lavare due volte con 200 ml di soluzione di lavaggio, quindi lasciare secondo risciacquo volume in pozzi e piastre di conservare ben chiusi a 4 ° C fino a colorazione.
5. Se i campioni sono stati conservati fisso a 4 ° C prima della colorazione, lavare due volte con 200 microlitri Buffer HCS immunofluorescenza prima di procedere con il protocollo di colorazione.
6. Preparare soluzione di lavoro di coniglio anti-tubulina βIII / Mouse anti-GFAP Anticorpi HCS primaria (6 piastra mL/96-well) come segue: Aggiungere 60 ml di ogni anticorpo primario scongelati a 5,88 ml di tampone HCS immunofluorescenza. Mescolare bene. Rimuovere precedenti Buffer immunofluorescenza risciacquare. Aggiungere 50 ml di soluzione di anticorpo primario in ciascun pozzetto e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
7. Rimuovere Anticorpo primariosoluzione. Lavare tre volte con 200 ul Buffer HCS immunofluorescenza.
8. Preparare la soluzione di lavoro di anticorpi HCS secondaria / Hoechst HCS nucleare Stain (6 piastra mL/96-well) come segue: aggiungere 30 ml di ogni anticorpo secondario scongelati e 30 ml di scongelato Hoechst HCS nucleare Stain a 5,91 ml di tampone HCS immunofluorescenza. Mescolare bene, proteggendo la soluzione dalla luce. Rimuovere precedenti HCS Buffer immunofluorescenza risciacquare. Aggiungere 50 ml di anticorpo HCS secondaria / Hoechst HCS soluzione nucleare Stain e incubare per 1 ora a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
9. Rimuovere HCS secondaria Anticorpo / Hoechst HCS soluzione nucleare Stain. Sciacquare due volte con 200 ul Buffer HCS immunofluorescenza.
10. Rimuovere precedenti HCS Buffer immunofluorescenza risciacquare. Sciacquare due volte con 200 ml di tampone HCS lavaggio, lasciando secondo risciacquo volume in pozzi.
11. Piatto di tenuta e di immagine subito, o conservare a 4 ° C al riparo dalla luce fino al momento per l'imaging.

Acquisizione di immagini e analisi:

12. Imaging e analisi di piatti colorati possono essere eseguite su una varietà di piattaforme disponibili HCS, tra cui il IN Analyzer Cell (GE Healthcare), ArrayScan (ThermoFisher scientifico) o Opera (Perkin Elmer). Alcune linee guida per l'imaging e di analisi sono riportati nella Tabella 1:

HCS222 Image Acquisition Linee guida
Rilevazione dei reagenti	Obiettivo obiettivo	Intervallo di eccitazione Filter [picco / larghezza di banda (nm)]	Intervallo di emissione Filtro [picco / larghezza di banda (nm)]
Hoechst HCS nucleare Stain	20X	360/40	460/40 (o 535/50 se necessario)
HCS anticorpo secondario, coniugati con Donkey anti-IgG	20X	480/40	535/50
HCS anticorpo secondario, Cy3-Donkey anti-mouse IgG	20X	535/50	600/50

HCS222 Image Analysis Linee guida
Cella di	Rivelazione	Segmentazione / misurazione	Fondamento logico
Numero di cellulare, Caratteristiche nucleare	Hoechst HCS nucleare Stain	Regione nucleare (460 nm di emissione del canale). Contare il numero di nuclei. Contenuto di DNA (intensità nucleare) o analisi settore nucleare sono inoltre possibili.	Usa numero cellulare, caratteristiche nucleari per determinare la perdita di cellule, fenotipi tossicità, ecc Può nuclei "filtro" per quelli associati βIII-tubulina o espressione GFAP di ottenere separare conta delle cellule neuronali e astrocitaria / caratterizzazioni (fortemente consigliato).
βIII-tubulina di espressione, neuriti escrescenza	HCS anticorpo secondario, coniugato FITC	Regione citoplasmatica (535 nm di emissione del canale). Segnale FITC possono essere utilizzati per distinguere corpi cellulari neuronali da neuriti (ad esempio, attraverso le zone delle cellule minimo / medio corpo, la lunghezza dei neuriti minimo / massimo e larghezza). Determinare parametri quali la lunghezza dei neuriti totale, conta neuriti / cellulari, ecc	Misure crescita dei neuriti può essere modulata durante la differenziazione neuronale o come risultato di danno chimico, stati di malattia, ecc Can "filtro" corpi cellulari per quelli associati βIII-tubulina espressione di ottenere distinte caratterizzazione neuronale (fortemente consigliato).
GFAP Espressione, Area astrociti	HCS anticorpo secondario, coniugato con Cy3-	Regione citoplasmatica (600 nm di emissione del canale). Cy3 segnale può essere utilizzato per definire astrocitaria segmentazione citoplasmatica. Determinare parametri come intensità media del segnale citoplasmatici, area delle celle, ecc	Espressione di GFAP e la zona delle cellule astrociti possono essere modulata durante lo sviluppo degli astrociti o come risultato di danno chimico, stati di malattia, ecc Can "filtro" corpi cellulari per quelli associati con l'espressione di GFAP di ottenere distinte caratterizzazione astrocitaria (fortemente consigliato).

. Tabella 1 Immagine Linee guida acquisizione e l'analisi - HCS222 βIII-Tubulin/GFAP (Co-Cultura) Assay

Rappresentante dei risultati:

Figura 1. βIII-tubulina e GFAP immunofluoreScence misti di colture di cellule neuronali di ratto.

Co-colture di astrociti primari di ratto sia con i neuroni dell'ippocampo di ratto primaria dell'ippocampo di ratto o cellule PC12 sono state generate dalla pre-placcatura astrociti per diversi giorni di cultura, seguito da semina neuronale. Neuroni primari sono state coltivate per altri 11 giorni, mentre PC12s sono stati coltivati ​​per altri 2 giorni in condizioni di differenziazione (bassi livelli sierici / NGF). Manipolazione delle cellule, la fissazione e immunostaining sono stati eseguiti secondo protocolli HCS222 test. Le cellule sono state proietta sulla GE IN cella Analyzer 1000 (3.3) a 20X (neuroni primario) o 10X (PC12) ingrandimento obiettivo e analizzati utilizzando il GE IN Workstation cellulare Analyzer 1000 (3.4) crescita dei neuriti e algoritmi di analisi multi target Pannello superiore.: immagini fuse di Hoechst HCS Stain nucleare (blu), βIII-tubulina (verde) e GFAP (rosso) fluorescenza. Analisi separata dei βIII-tubulina canale di fluorescenza permette di segmentazione crescita dei neuriti (al centro del pannello: corpi cellulari delineate nel blu (neuroni primari) o giallo (PC12), neuriti in verde (neuroni primario) o azzurro (PC12)). Analisi del canale GFAP permette di segmentazione astrociti (pannello di fondo: i nuclei in blu, citoplasma in verde). Segmentazione GFAP per il primario dei neuroni dell'ippocampo di ratto / astrociti co-coltura dimostra la capacità di distinguere tra nuclei / celle corpi che sono GFAP (+) (verde contorni) e quelli che sono GFAP (-) (rosso), che consente la conta delle cellule separate per neuroni e astrociti in un ambiente cultura mista.



Figura 2. Risposte dose di primari di ratto neurone dell'ippocampo / astrociti co-colture agli stress tossico.

Astrociti primari di ratto dell'ippocampo (P6) sono stati placcati in piastre a 96 pozzetti in terreni di coltura e coltura per 6 giorni. Neuroni dell'ippocampo di ratto primario (diretto da disgelo) sono poi stati seminati in cima alla pre-plated astrociti e coltivate in terreni di coltura per 11 giorni. Le cellule sono state trattate con diluizioni seriali di perossido di idrogeno o acrilamide (concentrazione max = 100mm e 10mm, rispettivamente) per le ultime 24 ore di cultura. Manipolazione delle cellule, la fissazione e immunostaining sono stati eseguiti secondo protocolli HCS222 test. Le cellule sono state proietta sulla GE IN cella Analyzer 1000 (3.3) a 20X (10 campi / pozzetto) ed analizzati (nucleare / citoplasma / segmentazione dei neuriti) utilizzando il cellulare di GE IN Workstation Analyzer 1000 (3.4) crescita dei neuriti e algoritmi di analisi multi target. I dati presentati sono media ± SEM, n = 3. Più parametri (crescita dei neuriti, intensità GFAP, zona astrociti e conta delle cellule neuronali o astrociti) sono stati indagati per dose-dipendente tendenze.

Discussione

Fino ad oggi, in esperimenti in vitro progettato per studiare la valutazione del rischio di neurotossicità utilizzando colture miste di neuroni e astrociti sono stati limitati. E 'ben accettato che le cellule gliali sono parte integrante nel fornire supporto spaziale e metabolico ai neuroni, e svolgono un ruolo cruciale nel modulare diverse funzioni neuronali, compresa la migrazione neuronale, la differenziazione e l'attività sinaptica. Astrociti gliali anche rilascio di citochine e altri fattori solubili, che sono in grado di indurre sia tolleranza effetti avversi su tessuti circostanti neuronale, oltre a promuovere neuronale di molte tossine. Dimostrare la profondità dei neuroni-gliali interazioni, in co-coltura studi, gli astrociti hanno dimostrato di proteggere i neuroni contro la tossicità di stress ossidativo, mentre l'alterazione delle funzioni astrociti, come la manutenzione di difesa antiossidante ed i livelli di energia cellulare, è stato dimostrato che criticamente influenzano la sopravvivenza neuronale. Recenti studi hanno suggerito che l'uso di astrociti in una neurotossicità in vitro di test del sistema può rivelarsi più rilevanti per la salute umana struttura del sistema nervoso centrale e la funzione di cellule neuronali da solo. Nonostante la crescente consapevolezza del significato fisiologico di neuroni, astrociti interazioni, è già stato difficile effettuare analisi quantitative di queste interazioni in cellule intatte. L'avvento di screening ad alta Contenuto consente lo sviluppo di potenti nuove analisi per affrontare questo.

In questo studio, abbiamo dimostrato che le analisi quantitative di più fenotipi neuronali e astrociti all'interno di un singolo test sono rese possibili da HCA. Nei neuroni primari abbiamo effettuato misurazioni quantitative dei marcatori di neurotossicità quali il numero dei neuroni, il conteggio dei neuriti e la lunghezza dei neuriti. Negli astrociti, gliosi reattiva è un biomarker noto di neurotossicità, caratterizzata da alterazioni nell'espressione GFAP, il numero di astrociti e la morfologia degli astrociti. Abbiamo dimostrato che ognuno di questi endpoint possono facilmente essere valutata tramite HCA. Questi studi supportano il concetto che HCA di neurali specifici biomarcatori potrebbe essere utilizzato come parte di una batteria di test in vitro per lo screening rapidamente un gran numero di sostanze chimiche per gli endpoint neurotossici.

Millipore HCS222 Alta kit Content Analysis per co-coltura di neuroni e astrociti si compone di alta qualità, reagenti e protocolli per il rilevamento simultaneo profilazione βIII-tubulina e proteina acidica fibrillare gliale (GFAP) in una vasta gamma di modelli cellulari di neurotossicità. La altamente convalidato reagenti forniti con questo kit consentono all'utente di standardizzare i test, ridurre al minimo dosaggio a dosaggio variabilità, riproducibile e per generare immagini con un elevato rapporto segnale-background rapporto.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rabbit Anti-βIII-Tubulin HCS Primary Antibody, 100X		Part No. CS201672	1 vial containing 300 μL Millipore HCS222 Kit Component
HCS Secondary Antibody (donkey anti-rabbit IgG, FITC conjugate), 200X		Part No. CS201649	1 vial containing 150 μL Millipore HCS222 Kit Component
Mouse Anti-GFAP HCS Primary Antibody, 100X		Part No. CS201671	1 vial containing 300 μL Millipore HCS222 Kit Component
HCS Secondary Antibody (donkey anti-mouse IgG, Cy3 conjugate), 200X		Part No. CS200437	1 vial containing 150 μL Millipore HCS222 Kit Component
H–chst HCS Nuclear Stain, 200X		Part No. CS200438	1 vial containing 150 μL Millipore HCS222 Kit Component
HCS Fixation Solution with Phenol Red, 2X		Part No. CS200434	1 bottle containing 100 mL Millipore HCS222 Kit Component
HCS Immunofluorescence Buffer, 1X		Part No. CS200435	1 bottle containing 1000 mL Millipore HCS222 Kit Component
HCS Wash Buffer, 1X		Part No. 2007643	1 bottle containing 500 mL Millipore HCS222 Kit Components
Acrylamide (Control Compound), 10X		Part No. CS201679	1 vial containing 500 μL of 1M acrylamide in dH2O Millipore HCS222 Kit Component
Hydrogen Peroxide (Control Compound), 10X		Part No. CS201730	1 vial containing 500 μL of 100 mM hydrogen peroxide in dH2O Millipore HCS222 Kit Components
K-252a (Control Compound), 250X		Part No. CS201741	1 vial containing 100 μL of 250 μM K-252a in DMSO Millipore HCS222 Kit Component
DMSO for Compound Serial Dilution		Part No. CS200441	1 bottle containing 10 mL Millipore HCS222 Kit Component
Compound Dilution Buffer		Part No. CS200442	1 bottle containing 25 mL Millipore HCS222 Kit Component
Plate Sealers		Part No. CS200443	10 each Millipore HCS222 Kit Components
tissue culture-treated black/clear bottom microplates
HCS imaging/analysis system