A Neuronal e astrocitária Ensaio Co-Cultura de Análise de Conteúdo de Alta de neurotoxicidade

Resumo

Este artigo descreve um protocolo de romance e de reagente conjunto projetado para a medição sensível de efeitos neurotóxicos de compostos e tratamentos em co-culturas de neurônios e astrócitos usando análise de conteúdo de alta. Resultados demonstram que a análise de conteúdo de alta tecnologia representa um romance empolgante para a avaliação de neurotoxicidade.

Resumo

Alta Content Analysis (HCA) ensaios de combinar células e reagentes de detecção com imagem automatizada e poderosos algoritmos de análise de imagem, permitindo a medição de múltiplos fenótipos celulares dentro de um único ensaio. Neste estudo, utilizamos HCA para desenvolver um teste de novela para neurotoxicidade. Neurotoxicidade avaliação representa uma parte importante da avaliação de segurança de medicamentos, bem como sendo um foco significativo dos esforços de protecção ambiental. Além disso, neurotoxicidade é também um bem aceita

Protocolo

Preparação de células:

1. Antes da semeadura de células para o ensaio, a cultura de neurônios / astrócitos em meios de crescimento até confluentes ~ 70-80% (a menos de células semeadura diretamente do degelo ou isolamento).
2. Separar as células dos frascos de cultura / placas através do método apropriado para o tipo de células de interesse. Se necessário, os poços casaco ensaio de placa com poli-D-lisina ou proteína de matriz extracelular para melhorar a adesão celular. Co-culturas de astrócitos e neurônios pode ser semeado simultaneamente ou seqüencialmente. Para seedings seqüencial, chapeamento de astrócitos primeiro como uma camada de "basal" é recomendado, seguido por plaqueamento neuronal e diferenciação, se necessário. Ajustar a densidade de células, conforme apropriado para o tipo de célula, o tempo da cultura subseqüente, os parâmetros de interesse, etc Dependendo da idade da cultura, fonte de células e densidade de semeadura, culturas primárias podem variar muito em taxa de proliferação, GFAP expressão ou crescimento de neuritos - é importante caracterizar e otimizar seu sistema de célula para fornecer a relevância biológica mais para o seu modelo experimental, bem como para fornecer para geração de imagens eficaz, segmentação e análise usando HCS (ver Figura 1). Depois de adicionar células a placa (células podem ser semeadas em 90 mL de mídia, para facilitar o tratamento com toxina, como descrito no Passo 3 abaixo), permitir que a placa se sentar sobre uma superfície plana em temperatura ambiente por 15-30 min, permitindo distribuição uniforme de células. Após este período, as células se desenvolvem em meios de crescimento (37 ° C / 5% CO ₂₎ por pelo menos 24 horas, em seguida, mudar as condições de cultura de diferenciação (por exemplo, soro baixo / NGF de PC12 células), conforme o caso. Continue cultura até atingir o nível desejado células de confluência ou diferenciação, mudando media em intervalos apropriados para o tipo de célula.
3. Tratamentos com células (compostos de controle, compostos de teste, etc) pode ser introduzido em qualquer momento durante este período da cultura, conforme apropriado para o tempo-curso de tratamento de interesse. Acrilamida, peróxido de hidrogênio e K-252 são fornecidas como compostos neurotóxicos controle. Reagentes suficientes são fornecidos para duplicar de 12 pontos curvas dose-resposta (incluindo uma dH ₂ O DMSO ou de controle situado no dose-resposta) para todas as cinco placas de 96 poços. Os compostos são fornecidos em concentração 250X (para K-252a, assumindo um tratamento máximo de 1 mM) ou 10X (para acrilamida e peróxido de hidrogênio, supondo que tratamentos máximo de 100 mm e 10 mm, respectivamente). Preparação tratamento recomendado envolve meia-log (1: √ 10) diluição em série do composto 250X em DMSO, seguido de diluição em tampão de diluição Composto de 10X (compostos controle 10X originários de dH ₂ O pode ser serialmente diluída diretamente em dH ₂ O estéril ou tampão de diluição Compound). 10 L de cada tratamento podem então ser adicionados ao mL 90 de meios de cultura já está presente em cada poço, para uma concentração final de 1X (0,4% DMSO ou 10% dH ₂ O). De dados de exemplo é fornecido por 24 ou 96 horas de tratamento composto de 37 ° C antes da fixação.

Fixação de células e coloração de imunofluorescência:

Nota: O tempo de coloração é de aproximadamente 2,5 horas pós-fixação. Não permitir que os poços a secar entre as etapas de coloração. Aspiração e dispensação de reagentes devem ser realizadas a taxas de fluxo baixo para diminuir a perda de células devido ao cisalhamento de fluidos. Todos os recomendados "por bem" volumes referem-se a um único poço de uma microplaca de 96 poços. Todos os recomendados 'por 96 poços da placa' volumes incluem excesso de 25% as perdas de líquido manipulação de volume. Todas as etapas são realizadas coloração à temperatura ambiente (RT). Todos os tampões e soluções de anticorpos são estáveis ​​por pelo menos 24 horas à temperatura ambiente.

4. No final do período de cultivo, pré-aquecido solução de fixação HCS (2X) a temperatura ambiente (RT) ou 37 º C, se desejar (12 placa mL/96-well). Em uma Cobertura de vapores químicos, adicionar 100 mL / poço diretamente para meios de cultura e permitir que a correção para 30 min em temperatura ambiente. Remover fixador / toxina contendo mídia e eliminar de acordo com os regulamentos para resíduos perigosos (ver MSDS). Se proceder imediatamente à coloração, lavar cada poço duas vezes com 200 mL de tampão de imunofluorescência HCS. Alternativamente, se as placas devem ser manchado em um momento posterior, lavar duas vezes com 200 mL de tampão de lavagem, enxágüe em seguida, deixar o volume segundo em poços e as placas loja hermeticamente fechado a 4 º C até coloração.
5. Se as amostras fixas foram armazenadas a 4 º C antes da coloração, lavar duas vezes com 200 mL de buffer HCS Imunofluorescência antes de prosseguir com protocolo de coloração.
6. Prepare solução de trabalho de Coelho Anti-βIII tubulina / Mouse Anticorpos Anti-GFAP HCS primária (6 placa mL/96-well) como segue: Adicionar 60 mL de cada anticorpo primário para 5,88 descongelado mL de tampão de imunofluorescência HCS. Misture bem. Remover o tampão de imunofluorescência anterior enxaguar. Adicionar 50 mL de solução de anticorpo primário a cada poço e incubar por 1 hora em temperatura ambiente.
7. Remover o anticorpo primáriosolução. Enxaguar três vezes com 200 mL de buffer de imunofluorescência HCS.
8. Preparar a solução de trabalho de HCS Anticorpo secundário / HCS Hoechst Nuclear Stain (6 placa mL/96-well) como segue: Adicionar 30 mL de cada anticorpo secundário descongelados e 30 mL de descongelado Hoechst HCS Nuclear Stain para 5,91 mL de tampão de imunofluorescência HCS. Misture bem, protegendo solução da luz. Remover anterior HCS buffer de imunofluorescência enxaguar. Adicionar 50 mL de HCS Anticorpo secundário / HCS Hoechst solução Nuclear Stain e incubar por 1 hora a RT, protegido da luz.
9. Remover HCS Secundária Antibody / Hoechst HCS solução Nuclear Stain. Enxágüe duas vezes com 200 mL de buffer de imunofluorescência HCS.
10. Remover anterior HCS buffer de imunofluorescência enxaguar. Enxágüe duas vezes com 200 mL de tampão de lavagem HCS, deixando o volume enxágüe segundo poços.
11. Placa de vedação e de imagem de imediato, armazenar ou placa a 4 º C protegido da luz até que esteja pronto para geração de imagens.

Aquisição e Análise de Imagem:

12. De imagem e análise de lâminas coradas pode ser realizada de uma variedade de plataformas disponíveis HCS, incluindo a IN Analyzer Cell (GE Healthcare), ArrayScan (ThermoFisher Científica) ou o Opera (Perkin Elmer). Algumas diretrizes para a imagem e análise são apresentadas na Tabela 1:

HCS222 Aquisição Diretrizes Imagem
Reagente de detecção	Lente objetiva	Faixa de excitação Filtro [pico / largura de banda (nm)]	Emissão Faixa de filtro [pico / largura de banda (nm)]
Hoechst HCS Nuclear Stain	20X	360/40	460/40 (ou 535/50, se necessário)
HCS Anticorpo secundário, FITC-Donkey anti-IgG de coelho	20X	480/40	535/50
HCS Anticorpo secundário, Cy3-Donkey anti-rato IgG	20X	535/50	600/50

HCS222 Análise Diretrizes Imagem
Parâmetro celular	Detecção	Segmentação / Medição	Fundamentação
Número de células, características nucleares	Hoechst HCS Nuclear Stain	Região nuclear (460 canais de emissão nm). Contar o número de núcleos. Conteúdo de DNA (intensidade nuclear) ou análises área nuclear também são possíveis.	Use o número de células, características nucleares para determinar a perda de células, fenótipos toxicidade, etc Can "filtro" para aqueles núcleos associados βIII-tubulina ou expressão GFAP para obter em separado contagem de células neuronais e astrocitária / caracterizações (fortemente recomendado).
βIII-tubulina Expressão, crescimento de neuritos	HCS Anticorpo secundário, FITC-conjugado	Região citoplasmática (535 nm de emissão do canal). FITC sinal pode ser usado para distinguir os corpos celulares neuronais de neurites (por exemplo, através de áreas de célula mínima / média do corpo, comprimentos neurite mínimo / máximo e largura). Determinar parâmetros como o comprimento neurite total, contagem de neurite / celular, etc	Medições de crescimento de neuritos pode ser modulada durante a diferenciação neuronal ou como resultado de uma lesão química, estados de doença, etc, podem "filtrar" os corpos celulares para aqueles associados com βIII-tubulina expressão para obter a caracterização neuronal distintos (fortemente recomendado).
GFAP Expressão, Área astrocitária	HCS Anticorpo secundário, Cy3-conjugados	Região citoplasmática (600 canais de emissão nm). Cy3 sinal pode ser usado para definir a segmentação do citoplasma de astrócitos. Determinar parâmetros como a intensidade de sinal média citoplasmática, área da célula, etc	GFAP expressão e área de células astrócitos pode ser modulada durante o desenvolvimento de astrócitos ou como resultado de uma lesão química, estados de doença, etc, podem "filtrar" os corpos celulares para aqueles associados com a expressão GFAP astrocitária para obter a caracterização distintos (fortemente recomendado).

. Tabela 1 Imagem Diretrizes de Aquisição e Análise - HCS222 βIII-Tubulin/GFAP Assay (Co-Cultura)

Resultados representativos:

Figura 1. βIII-tubulina e GFAP immunofluorescence de rato misturado culturas de células neurais.

Co-culturas de astrócitos do hipocampo de ratos primária com neurônios de rato, quer primária ou hipocampo de ratos células PC12 foram gerados por placas pré-astrócitos durante vários dias em cultura, seguido de semeadura neuronal. Neurônios primários foram cultivadas por mais 11 dias, enquanto PC12s foram cultivadas por mais dois dias sob condições de diferenciação (soro baixo / NGF). Manipulação de células fixação e imunomarcação foram realizadas de acordo com protocolos HCS222 ensaio. As células foram fotografadas no GE IN celular Analyzer 1000 (3.3) a 20X (neurônios primários) ou de ampliação objetiva de 10X (PC12) e analisados ​​com o GE IN celular Workstation 1000 Analyzer (3.4) crescimento de neuritos e algoritmos de análise multi-alvo Painel superior.: imagens fundidas de Hoechst HCS Nuclear Stain (azul), βIII-tubulina (verde) e GFAP fluorescência (vermelho). Análise em separado do canal de fluorescência βIII-tubulina permite a segmentação crescimento de neuritos (painel do meio: corpos celulares descritos no azul (neurônios primários) ou amarelo (PC12), neurites em verde (neurônios primários) ou azul claro (PC12)). Análise do canal de GFAP permite a segmentação de astrócitos (painel inferior: núcleos delineados em azul, o citoplasma em verde). GFAP segmentação para o primário do hipocampo de ratos neurônio / astrócitos co-cultura demonstra a capacidade de distinguir entre os núcleos / célula corpos que são GFAP (+) (verde contornos) e aqueles que são GFAP (-) (vermelho), permitindo a contagem de células separadas para neurônios e astrócitos em uma configuração de cultura mista.



Figura 2. Respostas dose de rato principal do hipocampo neurônio / astrócitos co-culturas a estresses tóxicos.

Astrócitos do hipocampo de ratos primária (P6) foram semeadas em placas de 96 poços em meio de crescimento e cultivadas por 6 dias. Neurônios de rato principal do hipocampo (direto de descongelar) foram semeadas em cima do pré-plated astrócitos e cultivadas em meio de crescimento por 11 dias. As células foram tratadas com diluições seriadas de acrilamida ou peróxido de hidrogénio (máx. = concentração 100mM e 10mM, respectivamente) para as últimas 24 horas de cultura. Manipulação de células fixação e imunomarcação foram realizadas de acordo com protocolos HCS222 ensaio. As células foram fotografadas no GE IN celular Analyzer 1000 (3.3) a 20X (10 campos / poço) e analisadas (nuclear / cytoplasmic / neurite segmentação) usando o GE IN celular Workstation 1000 Analyzer (3.4) crescimento de neuritos e algoritmos de análise multi-alvo. Os dados apresentados são média ± EPM, n = 3. Vários parâmetros (crescimento de neuritos, intensidade GFAP, área de astrócitos e contagem de células neuronais ou astrocitária) foram investigados por dose-dependente tendências.

Discussão

Até o momento, experimentos in vitro concebido para estudo de avaliação do risco de neurotoxicidade utilizando culturas mistas de neurônios e astrócitos têm sido limitados. É bem aceito que as células gliais são essenciais na prestação de apoio espacial e metabólico para os neurônios, e desempenham um papel crítico na modulação neuronal várias funções, incluindo a migração neuronal, diferenciação e atividade sináptica. Astrócitos gliais também liberam citocinas e outros fatores solúveis que são capazes de induzir ambos os tolerância respostas adversas no tecido circundante neuronal, bem como promover neuronal de muitas toxinas. Demonstrando a profundidade da neuronal-glial interações, em co-cultura estudos, os astrócitos foram mostrados para proteger os neurônios contra a toxicidade do estresse oxidativo, enquanto comprometimento das funções astrocíticos, tais como manutenção de defesa antioxidante e os níveis de energia celular, tem se mostrado influenciam criticamente a sobrevivência neuronal. Estudos recentes têm sugerido que o uso de astrócitos em um sistema de teste in vitro-neurotoxicidade pode ser mais relevantes para a estrutura do sistema nervoso central humano e função de células neuronais sozinho. Apesar da crescente conscientização da importância fisiológica do neuronal-astrocíticos interações, tem sido difícil de executar análises quantitativas dessas interações em células intactas. O advento de Triagem de conteúdo de alta possibilita o desenvolvimento de novos testes poderosa para lidar com isso.

Neste estudo, nós demonstramos que as análises quantitativas de vários fenótipos neuronais e astrocitária dentro de um único ensaio são possíveis por HCA. Em neurônios primários temos realizado medições quantitativas dos marcadores neurotoxicidade, como o número de neurônios, a contagem de neurite e comprimento neurite. Em astrócitos, gliose reativa é um biomarcador conhecido da neurotoxicidade, caracterizada por alterações na expressão de GFAP, o número de astrócitos e morfologia de astrócitos. Nós demonstramos que cada um destes parâmetros podem ser facilmente avaliada através de HCA. Estes estudos suportam o conceito de que HCA de neural específico biomarcadores poderiam ser usados ​​como parte de uma bateria de ensaios in vitro para tela rapidamente um grande número de produtos químicos para endpoints neurotóxicos.

HCS222 Millipore do kit de análise de conteúdo de alta para o co-cultura de neurônios e astrócitos é composto de reagentes de alta qualidade e protocolos para a detecção simultânea de perfis βIII-tubulina e proteína fibrilar glial ácida (GFAP) em uma ampla variedade de modelos celulares de neurotoxicidade. Os reagentes altamente validado, desde que com este kit permite que o usuário para padronizar os ensaios, minimize-ensaio para ensaio-variabilidade, e reproduzível gerar imagens com uma relação sinal-background-alta.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rabbit Anti-βIII-Tubulin HCS Primary Antibody, 100X		Part No. CS201672	1 vial containing 300 μL Millipore HCS222 Kit Component
HCS Secondary Antibody (donkey anti-rabbit IgG, FITC conjugate), 200X		Part No. CS201649	1 vial containing 150 μL Millipore HCS222 Kit Component
Mouse Anti-GFAP HCS Primary Antibody, 100X		Part No. CS201671	1 vial containing 300 μL Millipore HCS222 Kit Component
HCS Secondary Antibody (donkey anti-mouse IgG, Cy3 conjugate), 200X		Part No. CS200437	1 vial containing 150 μL Millipore HCS222 Kit Component
H–chst HCS Nuclear Stain, 200X		Part No. CS200438	1 vial containing 150 μL Millipore HCS222 Kit Component
HCS Fixation Solution with Phenol Red, 2X		Part No. CS200434	1 bottle containing 100 mL Millipore HCS222 Kit Component
HCS Immunofluorescence Buffer, 1X		Part No. CS200435	1 bottle containing 1000 mL Millipore HCS222 Kit Component
HCS Wash Buffer, 1X		Part No. 2007643	1 bottle containing 500 mL Millipore HCS222 Kit Components
Acrylamide (Control Compound), 10X		Part No. CS201679	1 vial containing 500 μL of 1M acrylamide in dH2O Millipore HCS222 Kit Component
Hydrogen Peroxide (Control Compound), 10X		Part No. CS201730	1 vial containing 500 μL of 100 mM hydrogen peroxide in dH2O Millipore HCS222 Kit Components
K-252a (Control Compound), 250X		Part No. CS201741	1 vial containing 100 μL of 250 μM K-252a in DMSO Millipore HCS222 Kit Component
DMSO for Compound Serial Dilution		Part No. CS200441	1 bottle containing 10 mL Millipore HCS222 Kit Component
Compound Dilution Buffer		Part No. CS200442	1 bottle containing 25 mL Millipore HCS222 Kit Component
Plate Sealers		Part No. CS200443	10 each Millipore HCS222 Kit Components
tissue culture-treated black/clear bottom microplates
HCS imaging/analysis system