Imaging Mismatch Reparatur und zellulären Reaktionen auf DNA-Schäden in Bacillus subtilis</em

Zusammenfassung

Ein detailliertes Protokoll ist für die Darstellung der Echtzeit Bildung von DNA-Reparatur-Komplexe beschrieben Bacillus subtilis Zellen.

Zusammenfassung

Prokaryoten und Eukaryoten zu DNA-Schäden reagieren, durch eine komplexe Reihe von physiologischen Veränderungen. Veränderungen der Genexpression, die Umverteilung der vorhandenen Proteine ​​und die Montage neuer Protein-Komplexe können durch eine Vielzahl von DNA-Schäden und nicht übereinstimmende DNA-Basenpaare stimuliert werden. Fluoreszenzmikroskopie ist als leistungsfähiges experimentelles Werkzeug zur Visualisierung und Quantifizierung von diesen und anderen Reaktionen auf DNA-Schäden und DNA-Replikation Status innerhalb der komplexen subzellulären Architektur einer lebenden Zelle zu überwachen verwendet worden. Translational Fusionen zwischen fluoreszierenden Reporter-Proteinen und Komponenten der DNA-Replikation und Reparatur Maschinen wurden verwendet, um die Signale zu bestimmen, die auf DNA-Reparatur-Proteine ​​an ihre spezifischen Läsionen

Protokoll

Wachsende Kulturen von Zellen für die Mikroskopie

1. Ein oder zwei Tage vor der Bildgebung, bereiten die B. subtilis Stamm, der translationalen Fusionsprotein Sie zu visualisieren. Testversion Runden Schritte 1A und 1B wird notwendig sein, um festzustellen, welche das Wachstum Zustand die besten Bilder Ihres Stammes zur Verfügung stellt. In den meisten Fällen sollten die Zellen während der exponentiellen Wachstumsphase abgebildet werden.

1. Für einige B. subtilis-Stämme (insbesondere Stämme, die schlecht wachsen, durch die Integration der translationale Fusion zwischen dem Gen von Interesse und GFP in seiner endogenen Locus), anfängliche Wachstum für zwei Tage vor der Bildgebung ist notwendig für qualitativ hochwertige Bilder. Am ersten Tag, Streifen der B. subtilis-Stamm, auf LB-Agar mit selektiven Antibiotikum (s) abgebildet werden beimpft und über Nacht bei 30 ° C. Am zweiten Tag, impfen 100 ul von 0,85% Kochsalzlösung mit einer einzelnen Kolonie, und führen Sie drei 10-fache serielle Verdünnungen auf LB-Agarplatten (mit selektiven Antibiotika), Plattieren 100 ul jeder Verdünnung durch Inkubation über Nacht bei 30 ° C. Am dritten Tag, wählen Sie die Verdünnung Platte mit Licht konfluenten Wachstum der Zellen. Licht konfluenten Wachstum auf einer Platte wird das Nährmedium mit einer gesunden, exponentiell wachsenden Starter Inokulum potenziell ergeben exzellente Bildergebnisse (siehe Schritt 4) liefern. Dieser Schritt ist besonders nützlich für die höchste Qualität Membran-Bildgebung mit der Fleck FM4-64.
   
2. Andere B. subtilis-Stämmen kann einfach auf selektive LB-Agar-Medium für einzelne Kolonien mit einer sterilen Stick am Tag vor der Bildgebung angewendet werden beimpft und über Nacht bei 30 ° C. Am folgenden Tag werden die Zellen auf dieser Platte ausreichend sein, um als Inokulum für die Bildgebung zu verwenden (siehe Schritt 4).
   
   HINWEIS: B. subtilis, werden über Nacht Kulturen in flüssigem Medium nicht angemessen auf eine Kombination der Sporenbildung und die Beschlussfähigkeit Antworten, die über einen längeren Zeitraum Lag-Phase Wachstum ¹ führen wird.

2. Am Morgen des Imaging, 10 ml S7 ₅₀ ^3.1 Medium in einem 125 ml sterilen Erlenmeyerkolben.

3. Resuspendieren der Zellen in bis zu 2 mL der S7 _{50 mittelgroßen} aus dem LB-Agar-Platte mit einzelnen Kolonien oder das Licht konfluenten Zellen zu einem Inokulum erhalten.

4. Fügen Sie genug S7 _{50 mittelgroßen} Zelle Inokulum auf die Erlenmeyerkolben mit 10 mL S7 _{50 mittelgroßen} für eine Kultur mit einer anfänglichen optischen Dichte bei 600 nm gemessen (OD ₆₀₀₎ von ~ 0,08 bis 0,1. Bei diesem Schritt ist es wichtig, mindestens eine 10-fache Luft bis mittlere Verhältnis haben. So verwenden wir 10 bis 12,5 ml beimpft Medium in einem 125 mL Erlenmeyerkolben.

5. Wachsen jeder Kultur bei 30 ° C bis die Kultur eine OD ₆₀₀ erreicht ~ 0,5-0,8. Schüttelwasserbäder mit Umdrehungen pro Minute 150 bis 200 bevorzugt. Kulturen mit DNA-schädigenden oder mismatch induzierende Mittel herausgefordert sollten in einem frühen exponentiellen Wachstumsphase werden OD _600, so dass die Zellen das Ziel zu erreichen OD ₆₀₀ mit der zusätzlichen Zeit des Wachstums, die für die Behandlung erforderlich ist (siehe Tabelle 1)
Zum Beispiel erfordert 2-Amino einer Stunde Behandlung und damit eine Kultur mit 2-Amino behandelt werden, sollten bei OD ₆₀₀ ~ 0,3-0,4 werden, so dass die eine Stunde Behandlung / Wachstum führt zu einer OD ₆₀₀ ~ 0,5-0,8, wobei Zellen sind bereit für die Bildgebung.

Probenvorbereitung

1. Pipette 300 pl kultivierten Zellen in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß.

2. Wenn Bildgebung von Zell-Membranen gewünscht wird, fügen 1:1000 Verdünnung von FM4-64 Membran-Färbung (Invitrogen) zu jeder Probe aus einer 1 mg / ml Stammlösung. Eine Titration von FM4-64 erforderlich, um die gewünschte Fluoreszenz-Signal zu erzielen. Ein typisches Titration Bereich liegt bei 1:100, 1:1000 und 1:10.000.

3. Lassen Sie die Proben bei Raumtemperatur für bis zu 10 Minuten oder zu sitzen, während die Folie wird mit 1% Agarose in 1X Spizizens Medium hergestellt, wie unten beschrieben (siehe Schritt 1 unter "Präparat").

4. Wenn die Konzentration der Zellen erforderlich ist, bevorzugen wir Filterung Zellen unter Verwendung eines 0,2 um-Filter mit einer Vakuumapparatur. Die Zellen können dann leicht von der Oberfläche des Filters mit PBS, eine andere geeignete Puffer oder Medium vor Visualisierung gewaschen werden.

Slide Vorbereitung

1. Bereiten Sie 1% Agarose mit 1X Spizizens.

5 ml 10X Spizizens Lager bis 45 ml ddH2O zusammen mit 0,5 g Agarose und Mikrowelle zu schmelzen. Hot geschmolzene Agarose ist schwierig, Pipette, und erstarrte Agarose wird nicht in die Pipettenspitze. Die Agarose sollte in einem Wasserbad äquilibriert auf eine Temperatur von ~ 55-65 ° C für sie die Pipettenspitze geben, ohne Verfestigung in der tip.

2. Draw 20 ul Spizizens mit 1% geschmolzener Agarose in die Pipettenspitze. Pipette einen Tropfen (etwa 1-2 ul) der Agarose-Lösung in jede Folie gut (wir benutzen 15-gut gleitet, siehe Tabelle 2) zu seicht Agarose Pads bilden. Die Agarose wird sofort erstarren. Folien müssen auch unmittelbar vor der Applikation der Zellen sein. Wenn die Agarose Pads bei Raumtemperatur allein gelassen werden, können sie innerhalb weniger Minuten austrocknen und unbrauchbar werden.

Agarose-Pads sollten zentriert und füllen jedes Loch aber minimale Höhe zu verhindern, dass das Deckglas, wenn Tröpfchen sind zu hoch (bubble-like) oder wenn die Probe breitet sich über die gut Grenze, einfach streichen die auch sauber und mit einer Kimwipe und anwenden neue Agarose-Pad.

3. Übernehmen Sie die gesamte 300 ul Probe (siehe Schritt 6), um die Folie, auf der Oberseite jeder Agarose Pad verteilt. Diese Menge an Zellen sollte ausreichen, um jedes Loch auf der Folie abdecken.

4. Lassen Sie die Folie mit Zellen geladen werden, um bei Raumtemperatur stehen lassen (23 ° C) für etwa 10 Minuten. Dieser Schritt wird für die Zellen auf dem Agarose-Pad zu unbeweglich und bereit für die Bildgebung niederlassen können. Für spezielle Bedürfnisse dieser Temperatur müssen möglicherweise geändert werden, zum Beispiel werden bei der Durchführung von Experimenten, die einen Temperatur-Shift ⁴ erfordern.

5. Absaugen entfernt das überschüssige Medium aus jeder Vertiefung, ohne die Pads selber.

6. Wenden Sie das Deckglas auf die Folie, Pressen fest und gleichmäßig, aber vorsichtig, über den Bereich der Folie. Vergewissern Sie sich, dass das Deckglas vor dem Schlitten und dass das Deckglas ist nicht über die Folie angehoben wird.

Visualisierung von Zellen

1. Viele verschiedene Fluoreszenz-Mikroskopen wird gut funktionieren. Es ist wichtig, zu einem 100X Ölimmersion haben. Die Simmons Lab verwendet:

• Olympus BX61 Mikroskop mit 1,45 NA TIRFM 100X Ölimmersionsobjektiv Objektiv ausgestattet
• Hamamatsu ORCAR ² CCD gekühlte Kamera
• Lumen 200 Bogen Metall (Vor-) Lichtquelle.
• Für die Detektion von GFP (FITC), Filter Anregung 460-500 und 510-560 Emission
• Für den Nachweis von FM4-64 (TRITC), Filter Anregung 510-560 und 572-648 Emission.
• Die Bilder wurden aufgenommen mit SlideBook 4,2 (Abbildung 1)

2. Bringen Sie die Zellen in den Fokus mit weißem Licht.

3. Nehmen Sie das Bild mit Hilfe geeigneter Filter für jedes Fluorophor.

Repräsentative Ergebnisse

Repräsentative Bilder angezeigt werden (Abbildung 1). GFP Brennpunkte sollte gut definiert, während FM4-64-Färbung sollte hell und klar, ^4-7. GFP oder Membran Bilder können pseudo-farbig mit einer beliebigen Farbe, um die höchste Bildqualität, ohne dass Daten verloren gehen vorgestellt werden können.

Abbildung 1: Repräsentative GFP Bilder von B. subtilis translationale Fusionsproteine. GFP-Proteine ​​sind in grün dargestellt, während FM4-64 Membranfärbung in rot dargestellt wird. Der weiße Maßstab zeigt 3 mu m (A) MutS-GFP [relevant Genotyp: mutS - gfp (SPC), amyE: Pspac mutL (cat)]. In Gegenwart von 600 ug / mL 2-Amino-und 1 mM IPTG. FM4-64-Signal wird nicht dargestellt, um deutlicher zu zeigen, die MutS-GFP Brennpunkte (B) MutL-GFP [relevant Genotyp: mutL: mutL-GFP (SPC)].. In Gegenwart von 2-Amino (C) DnaX-GFP [relevant Genotyp: DnaX: DnaX-GFP (SPC)]. (D) RecA-GFP [relevant Genotyp: recA:: recA-GFP (SPC)] in Gegenwart von 20 ng / mL Mitomycin C (E) tagC-GFP [relevant Genotyp: tagC: tagC-GFP (SPC) ] in Gegenwart von 1 pg / mL Mitomycin C.

Treatment / Konzentration oder Menge	Funktion	Die Zeit der Inkubation
Mitomycin C (MMC) [20 bis 150 ng / mL]	DNA Alkylierungsmittel	1 Stunde
2-Amino (2-AP) [600 ug / mL]	Missverhältnis zu induzieren	1 Stunde
Hydroxyurea (HU)	erschöpft dNTPs	3 Stunden
ultraviolettem Licht (UV) 20 J/m2	Thymin-Thymin-Dimeren und 6-4 Photoprodukte	variiert je nach Quelle, in der Regel 20 Sekunden
Grau (ionisierende Strahlung) von 5 bis 100 Gy	Doppelstrangbrüche, Einzel-Strangbrüchen und Grundschaden Websites	variiert je nach Quelle

"> Tabelle 1. Zusammenfassung von DNA-schädigenden und Mismatch induzierenden Behandlungen

Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
Multitest Rutsche, 15-gut	MP Biomedicals	6041505E
Mikroskop Deckglas	Fischer	12 bis 544-B
Agarose	Fischer	BP160-500
Mitomycin C	Sigma	M0503-2MG	mutagen, Handschuhe tragen
2-Amino	Sigma	A3509-250MG	Handschuhe
Hydroxyurea	Sigma	H8627-25G	Handschuhe
FM4-64	Invitrogen	T13320	lichtempfindlich

Tabelle 2. Liste der spezifischen Reagenzien und Geräte:

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Diskussion

Versuch und Irrtum sind erforderlich, um die Exposition Bedingungen für die Bilder von höchster Qualität für jeden Stamm zu finden, finden wir, dass 1 Millisekunde geeignet für weißes Licht Bilder, während die Exposition von 100 bis 2000 ms für GFP (FITC) und FM4-64 geeignet sind (TRITC ) Bilder. Belichtungszeit hängt von der Imaging-Geräte verwendet. Wir empfehlen die Verwendung eines Stammes pro 15-well Objektträger für die einfachsten Bildgebung, wie pad Qualität und Verbreitung von Zellen aus dem Pad Gr...

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Materialien