Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Oligodendrozyten Precursors

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein kleines Molekül-basiertes Protokoll zur Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC). Dieses Protokoll erzeugt Olig2 + NG2 + OPCs mit hohem Wirkungsgrad von 30 Tagen nach Differenzierung. Wir beschreiben eine Methode, die auf "Aufstocken" OPCs, dass Aktionspotentiale Feuer erzeugen kann.

Zusammenfassung

Oligodendrozyten sind die myelinisierenden Zellen des zentralen Nervensystems. Für regenerative Zelltherapie in demyelinisierenden Erkrankungen, gibt es großes Interesse bei der Ableitung eines reinen Population von Lineage-committed Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) für die Transplantation. OPCs werden durch die Aktivität des Transkriptionsfaktors Olig2 und Oberfläche Ausdruck eines Proteoglykan NG2 aus. Mit der GFP-Olig2 (G-Olig2) Maus embryonalen Stammzellen (MESC) Reporter Linie, optimierten wir die Bedingungen für die Differenzierung von mESCs in GFP + + Olig2 NG2 + OPCs. In unserem Protokoll, beschreiben wir zunächst die Generierung von Embryoidkörpern (EVG) aus mESCs. Zweitens beschreiben wir die Behandlung von MESC-derived EBs mit kleinen Molekülen: (1) Retinsäure (RA) und (2) ein Sonic Hedgehog (SHH)-Agonist purmorphamine (Pur) unter definierten Kulturbedingungen zu EB Differenzierung in die oligodendroglialen Linie zu lenken. Mit diesem Ansatz kann OPCs mit hohem Wirkungsgrad (> 80%) in einem Zeitraum von 30 Tagen erreicht werden. Zellen aus mESCs in diesem Protokoll ergeben, sind phänotypisch ähnlich OPCs aus primärem Gewebe Kultur abgeleitet. Die MESC-derived OPCs zeigen nicht die Spikes-Eigenschaft für eine Subpopulation von Gehirn OPCs in situ beschrieben. Um dies zu untersuchen elektrophysiologische Eigenschaft beschreiben wir die Erzeugung von spiking MESC-derived OPCs von ektopisch auszudrücken Na

Protokoll

Detaillierte Verfahren zur Erzeugung Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) aus GFP-Olig2 embryonalen Stammzellen der Maus (mESCs):

1. Maus ES-Zelllinie GFP-Olig2 (G-Olig2), wird von der American Type Culture Collection (ATCC) bezogen. Die mESCs werden routinemäßig alle 3 Tage passagiert auf einer bestrahlten Maus embryonale Fibroblasten (MEF) Feeder-Schicht. Die MEF-Zellen werden in 0,1% Gelatine beschichtete sechs gut Gewebekulturplatte mindestens einen Tag vor der Passage der WSR überzogen. Die MESC Kulturmedium Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) (Gibco) mit 20% fötalem Rinderserum (GIBCO), 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 0,1 mM β-Mercaptoethanol /, 1% nicht-essentiellen Aminosäuren ergänzt ( NEAA), und 1.000 U / ml Leukämie hemmender Faktor.
2. mES Kolonien trypsiniert (TrypLE, 5 min, 37 ° C) in einzelne Zellen, suspendiert in Knockout-Serum-Ersatz (KSR) Medium, dann werden die Zellen zu einer Costar Ultra-Low-Anlage Sechs-Well-Platte (Corning) in einer Zelle übertragen Dichte von 50.000 Zellen / cm ^2. Unter diesen Bedingungen bilden mESCs Embryoidkörpern (EBS). KSR Medium besteht aus-minimal essential medium (-MEM) mit 20% KSR, 1 mM Natriumpyruvat, 1% NEAA und 0,1 mM β-Mercaptoethanol / ergänzt.
3. Von Tag 4 bis Tag 7, Retinsäure (RA, 0,2 M) und purmorphamine (Pur, 1 M) enthalten, wie in Abb. gezeigt. 1A in KSR oder N2 Medium. Die N2 Medium-MEM mit 1X N2 zu ergänzen, 1 mM Natriumpyruvat, 1% NEAA und 0,1 mM β-Mercaptoethanol /. Das Medium wird täglich gewechselt.
4. Am Tag 8, EBs aufgeschlüsselte mit TrypLE (5min, 37 ° C) und vergoldet auf 0,01% Polyornithin-beschichtete Platten in OPC Medium, das von N2 mittel-und Fibroblasten besteht growth factor-2 (FGF-2, 20 ng / ml). Das Medium wird alle zwei Tage gewechselt.
5. Die Zellen werden trypsiniert (TrypLE, 3 min, 37 ° C) und replattiert etwa jede Woche, wenn sie konfluent geworden. Am Tag 30, zeigen mehr als 80% der Zellen GFP/Olig2 Ausdruck und sind NG2-positive, die charakteristisch für OPCs.
6. Um spiking OPCs zu generieren, die BacMam Na ^+-Kanal-Kit wird verwendet, um Na _v 1.2-Untereinheit in diese MESC-derived OPCs einzuführen. Die BacMam Reagenz (1 ml, Komponente A) wird mit PBS auf ein Gesamtvolumen von 5 ml gemischt. Dann wird die gemischte BacMam Reagenz in MESC-derived OPCs Kultur in einer 60 mm Kulturschale gegeben (bei 50-70% Konfluenz) vor, mit PBS gespült. Nach 2 Stunden Inkubation wird die gemischte BacMam Reagenz entfernt und durch OPC Medium mit 1X-Enhancer ergänzt ersetzt. Der Verstärker ist die Komponente B rekonstituiert in DMSO (Komponente C). Als nächstes wird nach zusätzlichen 2-Stunden-Inkubation das Medium mit Enhancer wird entfernt und durch vollständige OPC-Medium ersetzt. Die Zellen werden 24 Stunden später untersucht.

Repräsentative Ergebnisse:

Nach der Differenzierung Protokoll in Abb.. 1A, G-Olig2 mESCs wurden zunächst in KSR Medium und für 4 Tage ausgesetzt, um Embryoidkörpern (EVG) (Abb. 1B) zu bilden. Dann haben wir nacheinander behandelt die EBs mit RA und Pur. Die EBs zeigten keine GFP-Fluoreszenz an Tag 4 und äußerte starke GFP-Fluoreszenz bei D8 (Abb. 1B). Zu diesem Zeitpunkt wurden die EBs trypsiniert und vernickelt in N2-Medium mit Wachstumsfaktoren FGF-2 ergänzt. Nach weiteren Kultur für 22 Tage (D30), erreichte der Anteil der GFP + Zellen 80,3 ± 0,6% nach unseren Durchflusszytometrie Ergebnisse. Wie in Abb.. 1C, GFP +-Zellen mit NG2 Färbung konsequent (96,4 ± 1,3% der GFP-positive Zellen wurden NG2 positiv, und 94,8 ± 1,5% vom NG2 positive Zellen wurden GFP positive) überlagert. So exprimieren diese Zellen GFP/Olig2 und NG2, definieren sie als OPC.

Die MESC-derived OPCs (76 Zellen) nicht Aktionspotentiale auf Depolarisation (Abb. 2A) Feuer. Nach Transduktion mit einem Baculovirus Durchführung der Na _v 1.2-Untereinheit, könnten diese MESC-derived OPCs (94,1%, 16 von 17 Zellen) als Spike (Abb. 2B) eingestuft werden.

Abbildung 1. Differenzierung von GOlig-MESC in OPCs. (A) Schematische Darstellung des Protokolls der Embryoidkörper (EB)-basierte und Small Molecule-driven Differenzierung. Bei D8 wurden die EBs aufgeschlüsselt und vergoldet. Die Zellen wurden einmal pro Woche passagiert, wenn sie konfluent geworden. (B) D8, aber nicht D4 EBs, zeigte die GFP-Expression. (C) Immunfärbung von NG2 (rot) stand im Einklang mit GFP (grün) Expression auf D30. DAPI (blau) wurde verwendet, um die Kerne zu identifizieren. Maßstab: 20 mm.

Abbildung 2. Generierung von spiking OPCs aus nonspiking MESC-derived OPCs durch Virus-vermittelten Na _v-Kanal Ausdruck. (A) Die Membranpotential wurde auf -60 mV und MESC-derived OPCs hielt nicht Aktionspotentiale Feuer, auch wenn die Zelle depolarisiert auf 0 mV. (B) Ein Beispiel für MESC-derived OPCBrennen Aktionspotential (rot markiert) nach der viralen Transduktion.

Diskussion

Embryonale Stammzellen (ES-Zellen), aus einer Blastozyste Embryo isoliert, kann in allen Zelllinien des Organismus ^{3, 4} zu unterscheiden, bietet ein in vitro Modell für die Erforschung von frühen Entwicklung von Säugetieren, einschließlich Oligodendrozyten-Spezifikation. mESCs haben gezeigt, dass in Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) mit der Behandlung von Sonic Hedgehog (SHH) ⁵ zu unterscheiden. Darüber hinaus behält sich das Shh-induzierten OPC Differenzierung von mESCs das richtige Timing bei der Embryonalentwicklung ⁶ beobachtet. Daher ist die Art der In-vitro-Differenzierung von OPC mESCs als im Einklang mit dem, was von in vivo Entwicklung gelernt. Hier mit dem kleinen Molekülen RA und die Shh-Agonisten Pur, haben wir erfolgreich die G-Olig2 mESCs in GFP + + Olig2 NG2 + OPCs mit hohem Wirkungsgrad unterschieden.

OPCs, durch den Ausdruck der Proteoglykan NG2 ⁷ und die Helix-Loop-Helix-Transkriptionsfaktor Olig2 ⁸ gekennzeichnet, erzeugen Oligodendrozyten in den Entwicklungsländern und reifen ZNS, wo sie einen bedeutenden Prozentsatz (~ 5%) der gesamten Zellen und enthalten, sind die Haupt-proliferierenden Zelltyp ^9. Seit fast zwei Jahrzehnten haben Forscher Na _V-Kanäle gezeigt werden in einer Subpopulation von OPCs zum Ausdruck und kann auf Depolarisation ^{10, 11} aktiviert werden. Darüber hinaus wurde kürzlich bemerkenswerte Beobachtung ^9, die in in situ Ratte CNS weißen Substanz, OPCs (~ 50%) Aktionspotenziale erzeugt, wenn depolarisiert abhängig von der Expression von spannungsabhängigen Natrium (Na _V) Kanäle, und so konnte in spiking unterteilt werden und nonspiking Subpopulationen. Allerdings sind die Funktionen dieser spiking Eigenschaften noch weitgehend unbekannt. Wir fanden, dass, elektrophysiologisch, die MESC-derived OPCs mit dem Shh-abhängigen Protokoll differenzierte, nicht die gleiche wie die in situ Gehirn OPCs. Nach der Einführung Untereinheit Na _V 1.2 wurden diese stille MESC-derived OPCs in der Lage spiking.

So kann das Aufstocken / nonspiking MESC-derived OPCs und Differenzierung hier beschriebene Protokoll (1) Untersuchung der funktionellen Unterschiede zwischen Spike und nonspiking OPCs, (2) Screening neuer Faktoren, die Natrium-Kanal Ausdruck in der MESC-derived OPCs, fördern könnte zu erleichtern ( 3) Entwicklung und Optimierung der Differenzierung Protokoll der OPCs aus menschlichem ESC oder induzierten pluripotenten Stammzellen (IPSCs).

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEFs	GlobalStem	GSC-6001G
TrypLE Express	Invitrogen	12604
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R-2625
Purmorphamine	Cayman Chemical	10009634
FGF-2	EMD Millipore	GF003
BacMam NaV 1.2	Invitrogen	B10341