Diferenciação de células-tronco embrionárias em precursores oligodendroglial

Resumo

Descrevemos uma molécula baseada em pequenas protocolo para a diferenciação de células-tronco embrionárias de camundongos em células precursoras de oligodendrócitos (OPCs). Este protocolo gera Olig2 + + NG2 OPCs com alta eficiência por 30 dias de diferenciação. Nós também descrevem um método para gerar "spiking" OPCs que pode disparar potenciais de ação.

Resumo

Oligodendrócitos são as células myelinating do sistema nervoso central. Para terapia celular regenerativa em doenças desmielinizantes, há um interesse significativo na derivação de uma população pura de linhagem comprometida células precursoras de oligodendrócitos (OPCs) para transplante. OPCs são caracterizadas pela atividade da Olig2 fator de transcrição e expressão de superfície de um proteoglicano NG2. Usando o GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse com células-tronco embrionárias (MESC), linha repórter, nós otimizamos as condições para a diferenciação de mESCs em GFP + + Olig2 NG2 + OPCs. Em nosso protocolo, primeiro descrever a geração de corpos embrióides (EBs) de mESCs. Segunda, descrevemos o tratamento de MESC derivados EBs com pequenas moléculas: (1) ácido retinóico (AR) e (2) um ouriço sónico purmorphamine agonista (Shh) (Pur), sob condições de cultura definidas para direcionar a diferenciação EB na linhagem oligodendroglial. Por esta abordagem, OPCs pode ser obtido com alta eficiência (> 80%) em um período de 30 dias. Células derivadas de mESCs neste protocolo são fenotipicamente semelhante a OPCs derivados de cultura de tecidos primários. O OPCs MESC derivados não apresentam a propriedade spiking descrito para uma subpopulação de OPCs cérebro in situ. Para estudar esta propriedade eletrofisiológicos, descrevemos a geração de spiking MESC derivados OPCs por ectopicamente expressando Na

Protocolo

Procedimentos detalhados de geração de células precursoras de oligodendrócitos (OPCs) de células de camundongo GFP-Olig2-tronco embrionárias (mESCs):

1. Rato linha celular ES GFP-Olig2 (G-Olig2), é comprado a partir do American Type Culture Collection (ATCC). O mESCs são rotineiramente várias passagens a cada 3 dias para uma camada de fibroblastos irradiados embrionárias de rato alimentador (MEF). As células MEF são banhados em 0,1% de gelatina revestido de seis bem placa de cultura de tecidos, pelo menos, um dia antes passaging CES. O meio de cultura MESC é meio modificado Dulbecco Águia (DMEM) (GIBCO) suplementado com 20% de soro fetal bovino (GIBCO), 2 mM L-glutamina, um piruvato de sódio mM, 0,1 mM β-mercaptoetanol /, 1% aminoácidos não essenciais ( NEAA), e 1.000 U / ml fator inibitório da leucemia.
2. colônias MES são tripsinizados (TrypLE, 5 min, 37 ° C) em células individuais e suspensas em knockout soro substituição médio (KSR), então as células são transferidas para um anexo Costar ultra-baixo de seis bem placa (Corning) em uma célula densidade de 50.000 células / cm ^2. Nessas condições, mESCs formar corpos embrióides (EBs). Médio KSR consiste de-minimal meio essencial (-MEM) suplementado com 20% KSR, piruvato de sódio 1 mM, NEAA 1% e 0,1 mM β-mercaptoetanol /.
3. Do dia 4 ao dia 7, ácido retinóico (RA, 0,2 M) e purmorphamine (Pur, 1 M) são incluídos como mostrado na figura. 1A em KSR ou médio N2. O meio é N2-MEM contendo 1X suplemento N2, piruvato de sódio 1 mM, NEAA 1% e 0,1 mM β-mercaptoetanol /. O meio é alterado todos os dias.
4. No dia 8, EBs são desagregados utilizando TrypLE (5min, 37 ° C) e semeadas em 0,01% polyornithine revestido pratos em OPC meio que consiste em N2 médio e fator de crescimento de fibroblastos-2 (FGF-2, 20 ng / ml). O meio é trocada a cada dois dias.
5. As células são tripsinizados (TrypLE, 3 min, 37 ° C) e replated aproximadamente a cada semana, quando eles se tornam confluentes. No dia 30, mais de 80% das células mostram GFP/Olig2 expressão e são NG2-positivos, característica de OPCs.
6. Para gerar OPCs spiking, o Na ⁺ BacMam canal kit é usado para introduzir Na _v 1.2 subunidade nestes OPCs MESC derivados. O reagente BacMam (1 ml componente, A) é misturado com PBS para um volume final de 5 ml. Então, o reagente BacMam mista é adicionado em MESC derivados cultura OPCs em um prato de cultura 60 mm (na confluência 50-70%) antes da lavagem com PBS. Após a incubação 2 hr, o reagente BacMam misto é removido e substituído por OPC meio suplementado com 1X enhancer. O enhancer é o componente B reconstituída em DMSO (componente C). Em seguida, após incubação 2 hr adicional de meio com enhancer é removido e substituído com o meio OPC completa. As células são analisadas 24 horas mais tarde.

Resultados representativos:

Seguindo o protocolo de diferenciação mostrado na figura. 1A, G-Olig2 mESCs foram inicialmente suspensos em meio KSR e para 4 dias para formar corpos embrióides (EBs) (Figura 1B). Então, tratadas seqüencialmente os EBs com AR e Pur. O EBS não apresentaram fluorescência da GFP no dia 4 e expressa de fluorescência da GFP forte em D8 (Figura 1B). Neste ponto do tempo, os EBs foram tripsinizados e banhado em meio suplementado com N2 fatores de crescimento FGF-2. Após o cultivo mais de 22 dias (D30), a porcentagem de células GFP + atingiu 80,3 ± 0,6%, de acordo com nossos resultados de citometria de fluxo. Como mostrado na figura. 1C, GFP + células sobrepostas com NG2 coloração consistente (96,4 ± 1,3% de células GFP positivas foram NG2 positivo, e 94,8 ± 1,5% de células positivas foram NG2 GFP positivas). Assim, estas células expressam GFP/Olig2 e NG2, definindo-os como OPCs.

O OPCs MESC derivados (76 células) falhou ao fogo potenciais de ação sobre a despolarização (Fig. 2A). Após transdução com um baculovírus carregando a subunidade Na _v 1.2, estes OPCs MESC derivados (94,1%, 16, de 17 células) poderiam ser classificados como spiking (Fig. 2B).

Figura 1. Diferenciação de GOlig-MESC em OPCs. Scheme (A) mostrando o protocolo do corpo embrióides (EB) e baseada em pequena molécula de diferenciação-driven. No D8, os EBs foram desagregados e banhados. As células foram várias passagens uma vez por semana, quando eles se tornaram confluentes. (B) D8, mas não D4 EBs, mostraram expressão GFP. (C) A imunocoloração de NG2 (vermelho) foi consistente com a GFP (verde) expressão em D30. DAPI (azul) foi utilizado para identificar os núcleos. Barra de escala: 20 mm.

Figura 2. Geração de OPCs spiking de nonspiking MESC derivados OPCs por vírus mediada Na expressão _v canal. (A) O potencial de membrana foi realizada a -60 mV e MESC derivados OPCs não conseguiu acionar os potenciais de ação, mesmo quando a célula foi despolarizada a 0 mV. (B) Um exemplo de MESC derivados OPCdisparo do potencial de ação (destaque em vermelho) após a transdução viral.

Discussão

Células-tronco embrionárias (CES), isolado a partir de um embrião de blastocisto, podem se diferenciar em todas as linhagens de células do organismo ^{3, 4,} provendo uma in vitro sistema modelo para estudar o desenvolvimento de mamíferos adiantados, incluindo especificação de oligodendrócitos. mESCs foram mostrados para se diferenciar em células precursoras de oligodendrócitos (OPCs) com o tratamento de sonic hedgehog (Shh) ^5. Além disso, o Shh induzida diferenciação OPC a partir mESCs mantém o timing correto observado no desenvolvimento embrionário ^6. Assim, a natureza da diferenciação in vitro de mESCs OPC é considerado para ser coerente com o que foi aprendido com desenvolvimento in vivo. Aqui, usando a pequenas moléculas RA eo Pur agonista Shh, conseguimos diferenciada do mESCs G-Olig2 em GFP + + Olig2 NG2 + OPCs com alta eficiência.

OPCs, caracterizado pela expressão do proteoglicano NG2 ⁷ e do fator de transcrição hélice-alça-hélice Olig2 ^8, gerar oligodendrócitos no SNC em desenvolvimento e maduras, onde constituem uma percentagem significativa (~ 5%) do total de células e são os principal tipo de célula em proliferação ^9. Por quase duas décadas pesquisadores demonstraram Na canais _V são expressos em uma subpopulação de OPCs e pode ser activado a despolarização ^{10, 11.} Além disso, uma observação recente impressionante foi que em ⁹ no SNC de ratos situ substância branca, OPCs (~ 50%) gerados potenciais de ação quando despolarizada, dependendo da expressão de voltagem-dependentes de sódio (Na _V) canais, e, portanto, poderia ser subdividida em spiking e nonspiking subpopulações. No entanto, as funções dessas propriedades spiking são ainda desconhecidos. Descobrimos que, eletrofisiologicamente, o MESC OPCs derivados diferenciada com o protocolo Shh-dependente, não eram o mesmo que o cérebro em OPCs situ. Depois de introduzir subunidade Na _V 1.2, estas silêncio MESC derivados OPCs eram capazes de spiking.

Assim, o spiking / nonspiking MESC derivados OPCs e protocolo de diferenciação descrito aqui pode facilitar (1) estudar as diferenças funcionais entre spiking e nonspiking OPCs, (2) fatores de triagem novo que poderia promover a expressão dos canais de sódio na OPCs MESC derivados, ( 3) desenvolver e optimizar o protocolo de diferenciação de OPCs de humano ESC ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs).

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEFs	GlobalStem	GSC-6001G
TrypLE Express	Invitrogen	12604
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R-2625
Purmorphamine	Cayman Chemical	10009634
FGF-2	EMD Millipore	GF003
BacMam NaV 1.2	Invitrogen	B10341