Differenziazione delle cellule staminali embrionali in precursori degli oligodendrociti

Riepilogo

Descriviamo una piccola molecola a base di protocollo per la differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in cellule precursori degli oligodendrociti (OPC). Questo protocollo genera Olig2 + NG2 + OPC ad alta efficienza da 30 giorni di differenziazione. Abbiamo anche descrivere un metodo per generare "chiodare" OPC che può sparare potenziali d'azione.

Abstract

Oligodendrociti sono cellule mielinizzanti del sistema nervoso centrale. Per la terapia cellulare rigenerativa nelle malattie demielinizzanti, c'è notevole interesse nel derivare una popolazione di stirpe pura-committed cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) per il trapianto. OPC si distinguono per l'attività del Olig2 fattore di trascrizione e l'espressione superficiale di un NG2 proteoglicani. Utilizzando la GFP-Olig2 (G-Olig2) topo con cellule staminali embrionali (Mesc) linea reporter, abbiamo ottimizzato le condizioni per la differenziazione dei mESCs in Olig2 GFP + + + NG2 OPC. Nel nostro protocollo, per prima cosa descrivere la generazione dei corpi embrionali (EBS) da mESCs. In secondo luogo, si descrive il trattamento di Mesc derivati ​​EBS con piccole molecole: (1) acido retinoico (RA) e (2) un Sonic hedgehog (Shh) purmorphamine agonista (Pur) in condizioni cultura definita per dirigere la differenziazione EB nel lignaggio oligodendrogliali. Con questo approccio, OPC può essere ottenuto con alta efficienza (> 80%) in un periodo di tempo di 30 giorni. Cellule derivate da mESCs in questo protocollo sono fenotipicamente simile a OPC derivati ​​da colture cellulari primarie. Il Mesc derivati ​​OPC non mostrano la proprietà spiking descritto per una sottopopolazione di OPC cervello in situ. Per studiare questa proprietà elettrofisiologiche, si descrive la generazione di spiking Mesc derivati ​​OPC da ectopica esprimendo Na

Protocollo

Le procedure dettagliate di generare cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) da GFP-Olig2 cellule staminali embrionali di topo (mESCs):

1. Topo linea di cellule ES GFP-Olig2 (G-Olig2), viene acquistato dalla American Type Culture Collection (ATCC). Il mESCs sono diversi passaggi di routine ogni 3 giorni su un irradiato embrionale fibroblasti del mouse (MEF) strato alimentatore. Le cellule MEF sono placcati in 0,1% di gelatina rivestite sei pozzetti coltura tissutale almeno un giorno prima passaging il CES. Il terreno di coltura Mesc è medio Dulbecco modificato Eagle (DMEM) (GIBCO) integrato con il 20% fetale di siero bovino (GIBCO), 2 mM L-glutamina, 1 piruvato di sodio mM, 0,1 mM β-mercaptoetanolo /, 1% di acidi essenziali aminoacidi ( NEAA), e 1.000 U / ml fattore inibitorio leucemia.
2. colonie MES sono trypsinized (TrypLE, 5 min, 37 ° C) in celle singole e sospese nel siero sostituzione ad eliminazione diretta (KSR) medio, poi le cellule sono trasferiti ad un ultra-low attaccamento Costar sei pozzetti (Corning) in una cella densità di 50.000 cellule / cm ^2. In queste condizioni, mESCs formare corpi embrionali (EBS). Medio KSR è costituito da-minimal mezzo fondamentale (-MEM) arricchito con 20% KSR, 1 mM sodio piruvato, 1% NEAA, e 0,1 mM β-mercaptoetanolo /.
3. Dal giorno 4 al giorno 7, l'acido retinoico (RA, 0,2 M) e purmorphamine (Pur, 1 M) sono inclusi come mostrato in fig. 1A in KSR o medio N2. Il mezzo è N2-MEM contenente supplemento N2 1X, 1 mM di piruvato di sodio, 1% NEAA, e 0,1 mM β-mercaptoetanolo /. Il mezzo è cambiato ogni giorno.
4. Al giorno 8, EBS sono disaggregati utilizzando TrypLE (5 minuti, 37 ° C) e placcato su 0,01% polyornithine rivestite piatti medio OPC che consiste di media N2 e di crescita dei fibroblasti fattore-2 (FGF-2, 20 ng / ml). Il mezzo viene cambiata ogni due giorni.
5. Le cellule sono trypsinized (TrypLE, 3 min, 37 ° C) e saltuariamente circa ogni settimana quando diventano confluenti. Al giorno 30, oltre l'80% delle cellule mostrano GFP/Olig2 espressione e sono NG2-positivi, caratteristici OPC.
6. Per generare OPC spiking, il Na ⁺ canale BacMam kit viene utilizzato per introdurre Na _v 1.2 subunità in questi Mesc derivati ​​OPC. Il reagente BacMam (1 ml, componente A) viene mescolato con PBS per un volume finale di 5 ml. Poi, il reagente BacMam mista è aggiunto in Mesc derivati ​​cultura OPC in un piatto di cultura 60 mm (a 50-70 confluenza%) prima di risciacquo con PBS. Dopo 2 ore di incubazione, il reagente BacMam misto viene rimosso e sostituito con la media OPC integrato con 1X enhancer. Il potenziatore è il componente B ricostituito in DMSO (componente C). Poi, dopo ulteriori 2-ore di incubazione il mezzo con potenziatore viene rimosso e sostituito con il completo supporto OPC. Le cellule sono stati analizzati 24 ore più tardi.

Rappresentante dei risultati:

Seguendo il protocollo differenziazione mostrato in fig. 1A, G-Olig2 mESCs sono stati inizialmente sospesi in media KSR e per 4 giorni per formare corpi embrionali (EBS) (Fig. 1B). Poi, in sequenza trattati EBS con RA e Pur. L'EBS non ha mostrato alcuna fluorescenza GFP al giorno 4 ed ha espresso una forte fluorescenza GFP a D8 (Fig. 1B). A questo punto il tempo, l'EBS sono stati trypsinized e placcato in media N2 integrato con fattori di crescita FGF-2. Dopo la cultura ulteriore per 22 giorni (D30), la percentuale di cellule GFP + raggiunto 80,3 ± 0,6% secondo i risultati di citometria a flusso nostra. Come mostrato in fig. 1C, GFP + cellule sovrapposte con NG2 colorazione costantemente (96,4 ± 1,3% delle cellule GFP positive sono state positive NG2, e 94,8 ± 1,5% del NG2 cellule GFP positive sono state positive). Quindi, queste cellule esprimono GFP/Olig2 e NG2, definendoli come OPC.

Il Mesc derivati ​​OPC (76 celle) non è riuscito a fuoco i potenziali d'azione sulla depolarizzazione (Fig. 2A). Dopo trasduzione con un baculovirus porta la Na _v 1.2 subunità, questi Mesc derivati ​​OPC (94,1,% 16 di 17 celle) può essere classificato come spiking (Fig. 2B).

Figura 1. Differenziazione dei GOlig-Mesc in OPC. (A) Schema che mostra il protocollo del corpo embrionali (EB)-based e piccole molecole-driven differenziazione. Al D8, l'EBS sono stati disaggregati e placcato. Le cellule sono state diversi passaggi una volta a settimana quando sono diventati confluenti. (B) D8, ma non D4 EBS, ha mostrato un'espressione GFP. (C) immunocolorazione di NG2 (rosso) è stato coerente con GFP (verde) espressione a D30. DAPI (blu) è stato utilizzato per identificare i nuclei. Scala grafica: 20 mm.

Figura 2. Generazione di OPC spiking da nonspiking Mesc derivati ​​OPC da virus-mediata Na _v espressione canale. (A) Il potenziale di membrana si è tenuta a -60 mV e Mesc derivati ​​OPC non è riuscito a fuoco potenziali d'azione, anche quando la cella è stata depolarizzata a 0 mV. (B) Un esempio di Mesc derivati ​​OPCcottura potenziale d'azione (evidenziati in rosso) dopo la trasduzione virale.

Discussione

Le cellule staminali embrionali (ESC), isolate da un embrione blastocisti, possono differenziarsi in tutte le linee cellulari dell'organismo ^{3, 4,} fornendo un sistema di modello in vitro per lo studio precoce sviluppo dei mammiferi, compresa la specificazione degli oligodendrociti. mESCs hanno dimostrato di differenziarsi in cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) con il trattamento di Sonic hedgehog (Shh) ^5. Inoltre, il Shh differenziazione, indotta dal mESCs OPC conserva i tempi corretti osservata nello sviluppo embrionale ^6. Quindi, la natura del differenziamento in vitro OPC da mESCs è considerato coerente con quanto si è appreso dal vivo in fase di sviluppo. Qui, utilizzando il piccolo molecole RA e l'Pur agonista Shh, abbiamo differenziato con successo il G-Olig2 mESCs in Olig2 GFP + + + NG2 OPC con alta efficienza.

OPC, caratterizzato dall'espressione di proteoglicani NG2 ⁷ e l'elica-loop-elica fattore di trascrizione Olig2 ^8, generare oligodendrociti nel sistema nervoso centrale sviluppo e maturo, dove essi costituiscono una percentuale significativa (~ 5%) delle cellule totali e sono la principale tipo di cellule proliferanti ^9. Per quasi due decenni, i ricercatori hanno dimostrato Na canali _V sono espressi in una sottopopolazione di OPC e può essere attivato su depolarizzazione ^{10, 11.} Inoltre, una recente osservazione sorprendente ⁹ è stato che nel sistema nervoso centrale di ratto in situ della sostanza bianca, OPC (~ 50%) ha generato un potenziale d'azione quando depolarizzata seconda l'espressione del sodio voltaggio-dipendenti (Na _V) canali, e quindi potrebbe essere suddiviso in spiking e nonspiking sottopopolazioni. Tuttavia, le funzioni di queste proprietà spiking sono ancora largamente sconosciuti. Abbiamo scoperto che, elettrofisiologico, la Mesc derivati ​​OPC differenziato con il protocollo di Shh-dipendente, non erano la stessa in OPC cervello in situ. Dopo aver introdotto subunità Na _V 1.2, questi silenziosi Mesc derivati ​​OPC sono state in grado di spike.

Così, la spiking / nonspiking Mesc derivati ​​OPC e il protocollo di differenziazione descritto qui può facilitare (1) studiando le differenze funzionali tra spike e nonspiking OPC, (2) fattori di screening in grado di promuovere il canale di espressione di sodio nel Mesc derivati ​​OPC, ( 3) sviluppare e ottimizzare il protocollo di differenziazione delle OPC da ESC umane o cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs).

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEFs	GlobalStem	GSC-6001G
TrypLE Express	Invitrogen	12604
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R-2625
Purmorphamine	Cayman Chemical	10009634
FGF-2	EMD Millipore	GF003
BacMam NaV 1.2	Invitrogen	B10341