Isolating Stammzellen aus Soft-Gewebe des Bewegungsapparates

Zusammenfassung

Isolating adulten Stammzellen aus Muskel-Skelett Weichteile auf der Grundlage der Zelle Einhaltung Geschwindigkeit Kolben.

Zusammenfassung

Adulte Stammzellen sind seit langem in Bezug auf ihre Anwendung in der regenerativen Medizin diskutiert. Adulte Stammzellen haben eine große Aufregung für die Behandlung von verletzten und erkrankten Geweben durch ihre beeindruckenden Fähigkeiten, um multi-lineage Zelldifferenzierung und ihre Selbst-Erneuerung unterzogen Fähigkeit generiert. Am wichtigsten ist, haben diese Eigenschaften machten sie vorteilhaft für die Verwendung bei der autologen Stammzelltransplantation Therapien. Das aktuelle Protokoll wird der Leser auf die veränderten Vorbeschichtungszyklus Technik, bei der Weichteile des Bewegungsapparates, zB Sehnen und Muskeln, sind 1 einführen

Protokoll

In der Regel erfordert die vollständige geändert Vorbeschichtungszyklus Verfahren 1-2 Tage Vorbereitung, 1 Woche für die Durchführung der technischen Verfahren, 2-3 Tage der Zelle Identifikation mit Immunzytochemie, und eine zusätzliche 2-3 Wochen von Stammzellen Bevölkerung Expansion. Die Ausrüstung für die Stammzell-Kultur erforderlich sind, ähnlich wie bei anderen Zellkulturen, die eine Tischzentrifuge, CO _2-Inkubator, Laminar Flow Gewebekultur Kapuze und einem inversen Mikroskop mit Fluoreszenz-und einer digitalen Kamera ausgestattet sind. Die isolierten Stammzellen können auch geklont werden können und langfristig aufbewahrt in flüssigem Stickstoff für die aktuelle und zukünftige Studien ^1,2 sein. Alle Reagenzien und Materialien für dieses Verfahren verwendet werden, müssen steril sein und behandelt aseptisch.

Schritt 1: Vorbereitung

1. Collagen Mantel Gewebekulturschalen und Flaschen: Typ I Kollagen aus Kalbsleder (0,1 g in 1 Liter; Sigma-Aldrich) abgeleitet. Die Kunststoffprodukte zu beschichten sind: T-25 Flaschen, 6 oder 12-Well-Platten, Geschirr (60 und 100 mm, BD Falcon) nach wie vor 1,2 beschrieben. Schütteln Sie die Kunststoffprodukte jede halbe Stunde, 4 Stunden auf eine gleichmäßige Beschichtung des Kollagens zu gewährleisten. Das Kollagen wird dann entfernt. Und die beschichtete Kunststoffprodukte ist dann erlaubt, in der Gewebekultur Kapuze mit dem UV-Licht und die Haube sowohl auf trockenen, um die Sterilität zu gewährleisten, und schließlich wieder verschlossen oder abgedeckt für eine spätere Verwendung.
2. Bereiten Zellkulturmedium: 400ml DMEM (DMEM, hohe Glukose; Invitrogen), 50 mL Hitze inaktiviertes fötales Rinderserum (FBS, Invitrogen), 50 mL Pferdeserum (HS, Invitrogen) und 5 mL Hühnerembryo-Extrakt (CEE; Accurate Chemical Co. ) wird im Vakuum filtriert mit einem Einweg 0,22-um 500-ml sterile Filter-System (Corning) werden. Sterile Penicillin / Streptomycin-Lösung (Invitrogen) wird schließlich 100 Einheiten / ml zugesetzt werden. Die hergestellten Lösungen können bei 4 ° C für mindestens einen Monat gelagert werden. Diese Lösung wird verwendet, um die Zellen aus der Flasche lösen beim Aufteilen Kulturen oder der Vorbereitung der Zellen zur Transplantation.
3. Warm up-Lösungen für die Zell-Trennung: Die folgenden Reagenzien müssen bis zu 37 ° C erwärmt werden vor ihrem Einsatz für die Zell-Trennung: Hanks Salzlösung (HBSS, Invitrogen), 0,2% (wt / vol) Kollagenase Typ XI (Sigma -Aldrich), mit einem Durchschnitt von 3.200 Kollagen Verdauung Einheiten pro ml HBSS; Dispase 2,4 units/1mL (Invitrogen), 0,5% (wt / vol) Trypsin (Invitrogen).
4. Sterilisieren chirurgische Geräte in Vorbereitung: Chirurgischer Eingriff erfordern sterile OP-Instrumente, einschließlich: unterschiedlich große Zange, Mikro-Schere, Schere Iris und / oder Skalpellklingen. Zusätzlich, 15 und 50-mL Polypropylen-Zentrifugenröhrchen (BD Falcon); Zellsieb (Porengröße 70 m) (BD Falcon), 18 -, 23 - und 27-Gauge-Nadeln (BD PrecisionGlide) und 10 - oder 20-ml sterile Spritzen (BD).

Schritt 2: Gewebeproben, Isolation und mechanischen Dissoziation ^1-4

Die Gewebeproben werden unter einer sterilen Abzug durchgeführt und beinhalten frisch geernteten Sehnen und Muskulatur werden aus der Tibia oder soleus Muskeln der hinteren Gliedmaßen von Wildtyp-Mäusen (weiblich C57BL/6J, 4-5 Wochen alt oder jünger, Jackson erhalten Laboratory). Jede sichtbare Bindegewebe, Blutgefäße und Fettgewebe werden dann von der Biopsie-Proben entnommen. Die Gewebe der Sehnen und Muskeln werden dann vorsichtig unter einem chirurgischen Präpariermikroskop um Reste von Haut und Knochen entfernen identifiziert und in eine Schüssel mit kaltem (4 ° C) HBSS (ergänzt durch Zusatz von 5% der FBS). Die isolierten Gewebe werden dann separat auf Kollagen beschichtete Platten mit kaltem HBSS gelegt und wird zerkleinert (<1x1 mm ³⁾ in einem groben Brei mit Mikro-Schere und / oder Skalpellklingen werden.

Schritt 3: Enzymatische Verdauung der Gewebe:

Das zerkleinerte Gewebe wird dann enzymatisch gespalten durch eine Reihe von Schritten ^2,4,5

1. Übertragen Sie die zerkleinerten Gewebes Schlämmen in einzelne 15-ml-Tuben und Zentrifuge bei ~ 3500 rpm bei 4 ° C für 5 Minuten.
2. Entfernen Sie den Überstand mit HBSS gewaschen und wiederholen Sie die Zentrifugation erneut.
3. Entfernen Sie den Überstand und verdauen diese Schlämme durch Zugabe von 10 ml vorgewärmtem 0,2% Kollagenase Typ XI (Sigma). Inkubieren für 60 Minuten bei 37 ° C unter ständigem vorsichtiges Schwenken der Röhrchen. Alternativ kann durch die Hand zu schütteln alle 10 min.
4. Zentrifuge und resuspendieren diese Schlämme in 10 ml Dispase (2,4 Einheiten / ml, Gibco)-Lösung. Inkubieren für 45 Minuten bei 37 ° C, Schütteln mit der Hand oder sanft schaukelnden alle 10 min.
5. Zentrifuge und resuspendieren diese Schlämme in 10 ml 0,2% Trypsin HBSS-Lösung. Inkubation wird basierend auf dem Ausmaß, in dem die einzelnen Zellen aus dem Gewebe, das durch die Beobachtung der Aufhängung unter dem Mikroskop durchgeführt werden können freigesetzt werden, variieren. Es ist nicht zu empfehlen, 30 Minuten bei 37 ° C überschreiten mit Umdrehen der Röhrchen oder sanft schaukelnden alle 10 min.
6. Centrifuge die resultierende Zelles und Resuspension des Zellpellets in 10 ml Medium Proliferation (PM).
7. Dissoziieren die Zellsuspension, indem der Extrakt durch eine Reihe von Nadeln. Die Zellen werden dann 2 mal durch eine 18G weitergegeben, dann 23G, und schließlich eine 27G Nadel.
8. Pass der Zellextrakt durch eine 70-um Zellsieb.

Schritt 4: Preplating unterschiedliche Zellpopulationen auf die Zelladhäsion bei ^1-3 basiert isolieren

1. Zentrifuge und resuspendieren die Zellpellets in Proliferation Medium.
2. Platte der Zelle Mischungen auf eine Kollagen-beschichtete T-25-Kolben (oder 60 mm-Schale) und markieren Sie ihn als PP1. Die Zellsuspension sollte besitzt eine große Anzahl von brechenden Kernen und andere Ablagerungen unter dem Mikroskop beobachtet werden.
3. Bei 37 ° C in einer befeuchteten, 5% CO _2-Inkubator für 2 Stunden.
4. Transfer nicht anhaftenden Zellen zu einem neuen Collagen-beschichteten T-25-Kolben (oder 60 mm-Schale) und markieren Sie als PP2. 5 ml PM in die Platte gekennzeichnet PP1. Die frühen anhaftenden Zellen, die in den Kolben befestigen sind meist Myofibroblasten ^3.
5. Bringen Sie den Kolben in den Inkubator für weitere 24 Stunden, Transfer nicht anhaftenden Zellen zu einem neuen Collagen-beschichteten T-25-Kolben (oder Gericht) und markieren Sie ihn als PP3. 5 ml Medium Proliferation in der Platte bezeichnet PP2. Diese anhaftenden Zellen, die zu dieser Kolben befestigen sind meist Fibroblasten ^2,3.
6. Zurück Flaschen in den Inkubator und wiederholen Sie den Vorgang in einem anderen 24 Stunden, bis der Bevölkerung PP6 erstellt. Halten Sie jede Gruppe von suspendierten Zellen und lassen sie sich zu vermehren und untersuchte sie regelmäßig mit einem inversen Mikroskop. PP3-PP4 sind meist Myoblasten während Muskel-Satelliten-Zellen sind oft vor allem in PP5 ^{2 zu} sehen.
7. Die meisten der langsam anhaftenden Zellen in der Regel durch PP6 befestigen. In diesem Stadium erscheinen die Zellen kleine, runde, Lichtbrechung und sind sehr spärlich an Zahl und gelten als eine Stammzelle Bevölkerung 1,2 sein.

Schritt 5: Identifizierung und Ausbau von isolierten Stammzellen

1. Die isolierte PP6 Zellen sind sehr gering an Zahl und müssen in FBS reiche Proliferation Medium (20% FBS in DMEM), die täglich gewechselt beibehalten werden. Die meisten Zellen im PP6 Kultur sterben in den folgenden 1-2 Wochen der Kultivierung, sondern eine große, gesunde PP6 Bevölkerung ist in der Regel nach einer weiteren 1-2 Wochen nach der Erweiterung geschaffen. Die Stammzellen aus Mäusen isoliert hoch ausdrückliche Stammzellen-Antigen 1 (SCA1), CD34, fetale Leber-Kinase 1 (Flk1) und andere Stammzellen Marker ^1,2,6,7, die visualisiert werden über immunzytochemische Färbung kann. Diese Stammzellen weisen auch mehrere Differenzierung Kapazitäten ^3,6,8.
2. Die isolierten Zellen werden gepflegt und ausgebaut zu einem niedrigen Zelldichte in der Kultur (12-Well-Schalen bei 50-100 Zellen / Well oder <20-30% Konfluenz in der Flasche oder Schale), die Differenzierung ^1,2 zu vermeiden. Sehr wenige Zellen bilden Klone während der Expansion, und diese geklonten Stammzellen können lange Zeit Proliferation (LTP) für jeden anderen Kompetenz-Studien unterzogen. Das geklonte Stammzellen auch speichern kann in flüssigem Stickstoff mit allgemeinen Zelle Speicherung Verfahren, z. B. PM-Medium mit 10% DMSO. Machen Sie eine Reihe von niedrigen Durchgang Aktien der Stammzellen für alle anderen Backup-Studien.

Diskussion

Es wurde erkannt, dass einige adulten Geweben mehrere Stammzellen enthalten. In den letzten Jahren des Studiums, haben Stammzellen in das weiche Gewebe des Bewegungsapparates, einschließlich Skelettmuskel und Sehne festgestellt. Das aktuelle Protokoll Einzelheiten eines Verfahrens, wie die modifizierte Vorbeschichtungszyklus Technik, die bereits erfolgreich in unserem Labor verwendet werden, um adulte Stammzellen aus Sehnen und Skelettmuskulatur zu isolieren bekannt. Mit dem modifizierten Vorbeschichtungszyklus Technik...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	#11995-073
FBS	Invitrogen	#10437-028
Heat-inactivated horse serum	Invitrogen	#26050-088
Chick embryo extract	Accurate Chemical	#CE650T-10
100U ml penicillin/streptomycin	Invitrogen	#15140-122
Dulbecco's PBS	Invitrogen	#14190-250
Hank's Buffered Salt Solution	Invitrogen	#24020-117
Collagenase type XI 0.2%(wt/vol)	Sigma-Aldrich	#C7657
Dispase2.4U ml	Invitrogen	#17105-041
Trypsin-EDTA0.5%(wt/vol) (10x;5g liter trypsin (1:250)	Invitrogen	#15400-054
Collagen for coating flask : Type I collagen derived from calf skin 0.1 g liter	Sigma-Aldrich	#C-9791
DMSO	Sigma	#D-2650