Isolar células-tronco de tecidos moles músculo-esqueléticas

Resumo

Células adultas isolando-tronco de tecidos moles músculo-esqueléticas com base na velocidade da célula a adesão ao frasco.

Resumo

Células-tronco adultas têm sido discutidas em relação à sua aplicação na medicina regenerativa. Células-tronco adultas têm gerado uma grande emoção para o tratamento de tecidos lesionados e doentes, devido à sua capacidade impressionante de se submeter multi-linhagem diferenciação celular e sua capacidade de auto-renovação. Mais importante ainda, essas qualidades fizeram-lhes vantajoso para uso em terapias de transplante autólogo de células. O protocolo atual irá introduzir os leitores à técnica preplate modificado onde os tecidos moles do sistema músculo-esquelético, por exemplo, tendão e músculo, são um

Protocolo

Em geral, o procedimento completo preplate modificada exige 1-2 dias de preparação, uma semana de realizar o procedimento técnico, 2-3 dias de identificação de células com imunocitoquímica, e um adicional de 2-3 semanas de tronco expansão da população celular. Os equipamentos necessários para a cultura de células-tronco são semelhantes ao de sistemas de célula de outra cultura, que inclui uma Centrífuga de bancada, incubadora de CO _2, câmara de fluxo laminar de cultura de tecidos e um microscópio invertido equipado com fluorescência e uma câmera digital. As células-tronco isoladas também podem ser clonados e pode ser armazenado a longo prazo em nitrogênio líquido para os ^1,2 estudos atuais ou futuras. Todos os reagentes e materiais utilizados para este procedimento deve ser estéril e manuseados assepticamente.

Etapa 1: Preparação

1. Colágeno casaco pratos de cultura de tecidos e frascos: colágeno tipo I derivado do bezerro de pele (0,1 g em 1 litro; Sigma-Aldrich). O plasticware para revestir inclui: T-25 frascos, 6 ou 12 pratos bem, pratos (60 e 100 mm, BD Falcon) como descrito anteriormente 1,2. Agite suavemente o plasticware cada meia hora, durante 4 horas para garantir até mesmo revestimento do colágeno. A solução de colágeno é então removido. E o plasticware revestido é então deixada para secar na capa de cultura de tecidos com a luz UV eo capô tanto, para garantir a esterilidade e, finalmente, recapeadas ou cobertas para uso posterior.
2. Prepare meio de cultura celular: 400mL DMEM (DMEM, glicose alta, Invitrogen), 50 ml de calor de soro fetal bovino inativado (FBS, Invitrogen), 50 ml soro de cavalo (HS, Invitrogen), e 5 mL Extrato de embrião de galinha (CEE; Accurate Chemical Co. ) será filtrada a vácuo através de um descartáveis ​​0,22 M-500-ml sistema de filtro estéril (Corning). Estéril de penicilina / estreptomicina solução (Invitrogen) será adicionado finalmente 100 Unidades / mL. As soluções preparadas podem ser armazenadas a 4 ° C durante pelo menos um mês. Esta solução é usada para separar as células do frasco quando as culturas divisão ou preparar as células para transplante.
3. Warm up soluções para isolamento de células: Os reagentes a seguir precisam ser aquecidos a 37 ° C antes da sua utilização para o isolamento de células: Solução de Hank Sal Buffered (HBSS, Invitrogen); 0,2% (wt / vol) colagenase do tipo XI (Sigma -Aldrich), com uma média de 3.200 unidades de digestão de colágeno por mL HBSS; Dispase 2,4 units/1mL (Invitrogen), 0,5% (wt / vol) de tripsina (Invitrogen).
4. Esterilizar equipamentos cirúrgicos em preparação: O procedimento cirúrgico requer instrumentos cirúrgicos estéreis, incluindo: diferentes tamanhos fórceps, micro-tesouras, tesoura de íris e / ou lâminas de bisturi. Além disso, 15 e 50 mL tubos de polipropileno de centrifugação (BD Falcon); filtro Cell (tamanho dos poros 70 m) (BD Falcon); 18 -, 23 - e 27-gauge agulha (BD PrecisionGild) e 10 - ou 20 ml seringas esterilizadas (BD).

Passo 2: biópsias de tecidos, isolamento e dissociação mecânica ^04/01

As biópsias de tecido são realizados sob uma capa de cultura estéreis e incluem recém-colhidas tendões e músculos esqueléticos são obtidos a partir dos músculos sóleo tíbia ou do membro posterior de camundongos selvagens (C57BL/6J Feminino, 4-5 semanas de idade ou mais jovens, Jackson laboratório). Qualquer tecido conjuntivo visíveis, vasos sanguíneos e tecido adiposo são então removidas das amostras de biópsia. Os tecidos de tendão e músculo são, então, cuidadosamente identificados sob um microscópio cirúrgico de dissecação para remover restos de pele e osso e colocada em um prato contendo frio (4 ° C) HBSS (suplementado com acrescentar 5% de FBS). Os tecidos isolados são então colocados separadamente em pratos de colágeno revestido contendo HBSS frio e será picada (3) em uma pasta grossa usando micro-tesoura e / ou lâminas de bisturi.

Passo 3: A digestão enzimática dos tecidos:

O tecido é então enzimaticamente picada dissociado através de uma série de passos ^2,4,5

1. Transferência de suspensões de tecido picada em separado, 15 ml tubos e centrifugar a 3.500 rpm ~ a 4 ° C por 5 minutos.
2. Remover o sobrenadante, lavar com HBSS e repita a centrifugação novamente.
3. Remover o sobrenadante, e digerir essas pastas, adicionando 10 ml de pré-aquecida 0,2% de colagenase tipo XI (Sigma). Incubar por 60 minutos a 37 ° C, enquanto continuamente balançando suavemente os tubos. Alternativamente, agitar a mão a cada 10 minutos.
4. Centrifugar e ressuspender essas suspensões em 10 ml dispase (2,4 Unidades / mL, Gibco) solução. Incubar por 45 minutos a 37 ° C, agitando delicadamente com as mãos ou balançar a cada 10 minutos.
5. Centrífuga e re-suspender estas lamas em 10 ml de solução de tripsina 0,2% HBSS. De incubação varia de acordo com a medida em que as células individuais são liberados a partir de tecidos que podem ser realizados através da observação da suspensão ao microscópio. Não é recomendável ultrapassar 30 minutos a 37 ° C com invertendo os tubos ou balançando suavemente a cada 10 minutos.
6. Centrífuga da célula, resultandos e re-suspender o pellet celular em 10 ml de Proliferação Médio (PM).
7. Dissociar a suspensão de células, passando o extrato através de uma série de agulhas. As células são então passadas duas vezes através de um 18G, em seguida, uma 23G e, finalmente, uma agulha 27G.
8. Passe o extrato celular através de um filtro de células 70 mícrons.

Passo 4: Preplating para isolar populações de células diferentes com base em taxa de adesão celular ^03/01

1. Centrifugar e ressuspender o pellets de células em meio de proliferação.
2. Misturas placa da célula em um colágeno revestido frasco T-25 (ou 60 prato mm) e marcá-la como PP1. A suspensão de células devem ser observados como possuindo um grande número de núcleos de refração e outros detritos sob o microscópio.
3. Incubar a 37 ° C em um umidificado, 5% incubadora de CO ₂ por 2 horas.
4. Transferência de células não-aderentes a um novo colágeno revestido T-25 frasco (ou 60 prato mm) e marcar é tão PP2. Adicionar 5 ml da PM na placa rotulados PP1. As células iniciais aderindo, que atribuem ao balão são na sua maioria miofibroblastos ^3.
5. Devolver os frascos para a incubadora por mais 24 horas, a transferência de células não-aderentes a um novo colágeno revestido T-25 frasco (ou prato) e marcá-la como PP3. Adicionar 5 ml de meio de proliferação na placa rotulados PP2. Estas células aderentes, que atribuem a este frasco são principalmente fibroblastos ^2,3.
6. Frascos de retorno para a incubadora e repita o procedimento em mais 24 horas até PP6 população é criada. Manter cada grupo de células em suspensão e permitir que eles se proliferam e examiná-los regularmente usando um microscópio invertido. PP3 PP4-são principalmente os mioblastos, enquanto as células musculares satélite são muitas vezes vistos principalmente no PP5 ^2.
7. A maioria das células lentamente aderindo tipicamente anexar por PP6. Nesta fase, as células parecem pequenos, refração, redondos de luz e são muito escassos em número e são considerados uma haste 1,2 população celular.

Passo 5: Identificação e expansão de células-tronco isoladas

1. O isolado PP6 células são muito poucos em número e precisam ser mantidos em meio de proliferação FBS ricos (20% FBS em DMEM), que é trocada diariamente. A maioria das células presentes na cultura PP6 morrer durante os seguintes 1-2 semanas de cultivo, mas um grande PP6 população saudável é geralmente criado após um adicional de 1-2 semanas de expansão. As células-tronco isoladas de camundongos altamente expressar antígenos de células-tronco 1 (SCA1), CD34, quinase fígado fetal 1 (Flk1), e marcadores-tronco outros ^1,2,6,7 que pode ser visualizado através de coloração imuno-histoquímico. Essas células-tronco também apresentam capacidades de diferenciação múltiplas ^3,6,8.
2. As células isoladas são mantidas e expandidas com uma densidade baixa de células em cultura (12-bem pratos a 50-100 células / poço ou 1,2 diferenciação. Muito poucas células, formam clones durante a expansão, e essas células-tronco clonadas podem sofrer proliferação tempo (LTP) para quaisquer estudos competência outros. As células-tronco também podem ser clonados loja em nitrogênio líquido através de procedimentos gerais de armazenamento de células p.ex PM com DMSO 10%. Fazer uma série de unidades populacionais de baixa passagem das células-tronco para os estudos de outros para trás.

Discussão

Foi reconhecido que alguns tecidos adultos contêm células-tronco múltiplas. Ao longo dos últimos anos de estudo, células-tronco têm sido detectadas nos tecidos moles músculo-esqueléticas, incluindo o músculo esquelético e tendão. Este protocolo atual detalhes de um procedimento, conhecido como a técnica preplate modificado, que tem sido utilizado com sucesso em nosso laboratório para isolar células-tronco adultas a partir de tendões e músculo esquelético. Usando a técnica preplate modificado descrito a...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	#11995-073
FBS	Invitrogen	#10437-028
Heat-inactivated horse serum	Invitrogen	#26050-088
Chick embryo extract	Accurate Chemical	#CE650T-10
100U ml penicillin/streptomycin	Invitrogen	#15140-122
Dulbecco's PBS	Invitrogen	#14190-250
Hank's Buffered Salt Solution	Invitrogen	#24020-117
Collagenase type XI 0.2%(wt/vol)	Sigma-Aldrich	#C7657
Dispase2.4U ml	Invitrogen	#17105-041
Trypsin-EDTA0.5%(wt/vol) (10x;5g liter trypsin (1:250)	Invitrogen	#15400-054
Collagen for coating flask : Type I collagen derived from calf skin 0.1 g liter	Sigma-Aldrich	#C-9791
DMSO	Sigma	#D-2650