Изоляция стволовых клеток из мягких тканей опорно-двигательного

Резюме

Изоляция взрослых стволовых клеток из мягких тканей опорно-двигательного аппарата на основе соблюдения скорости клеток к колбе.

Аннотация

Взрослые стволовые клетки уже давно обсуждается в отношении их применения в регенеративной медицине. Взрослые стволовые клетки породили много шуму для лечения раненых и больных тканей в связи с их впечатляющими возможностями для прохождения нескольких линии дифференциации клеток и их самообновление способности. Самое главное, эти качества сделали их выгодно для использования в аутологичной трансплантации клеток терапии. Текущего протокола представит читателям изменение preplate техники, где мягких тканей опорно-двигательного аппарата, например, сухожилия и мышцы, являются: 1

протокол

В общем, полное изменение preplate процедура требует 1-2 дней подготовки, 1 неделя выполнения технических процедур, 2-3 дней клеточной идентификации с иммуноцитохимия, и дополнительные 2-3 недели стволовых расширения популяции клеток. Оборудования, необходимого для стволовых клеточных культур аналогичны других систем культуры клеток, который включает настольные центрифуги, СО ₂ инкубатора, ламинарный поток тканевой культуры капот и инвертированный микроскоп оснащен флуоресценции и цифровой камеры. Изолированных стволовых клеток также может быть клонирован и может храниться долгосрочный в жидком азоте в течение текущих или будущих ^1,2 исследованиях. Все реагенты и материалы, используемые для этой процедуры должны быть стерильными и обрабатывается асептическим.

Шаг 1: подготовка

1. Коллаген пальто культуре ткани блюд и фляги: I тип коллагена производные из телячьей кожи (0,1 г на 1 л; Sigma-Aldrich). Пластик для покрытия включает в себя: Т-25 колб, 6 или 12 и тарелки, блюда (60 и 100 мм, BD Falcon), как описано выше 1,2. Осторожно встряхните Пластик каждые полчаса, в течение 4 часов, чтобы гарантировать даже покрытие коллагена. Раствора коллагена затем удаляется. И покрытием Пластик затем высушивают в капюшоне культуре ткани с УФ-светом и капот, как на, для обеспечения стерильности, и, наконец, recapped или покрытые для дальнейшего использования.
2. Подготовка культуре клеток среды: 400 мл DMEM (DMEM, высокий уровень глюкозы; Invitrogen), 50 мл Тепло Инактивированная эмбриональной телячьей сыворотки (FBS, Invitrogen), 50 мл лошадиной сыворотки (HS, Invitrogen) и 5 ​​мл куриного эмбриона экстракт (ЦВЕ; Точная химическая компания ), будут отфильтрованы с помощью вакуумного одноразовые 0.22-мкм на 500 мл стерильной системе фильтров (Corning). Стерильные пенициллина / стрептомицина решение (Invitrogen) будет добавлена ​​в конце концов 100 ед / мл. Готовые решения можно хранить при температуре 4 ° С в течение не менее одного месяца. Это решение используется для отделить клетки из колбы, когда расщепление культур или подготовки клеток для трансплантации.
3. Разминка решений для мобильных изоляции: следующие реагенты должны быть прогревается до 37 ° C до их использования для сотовых изоляции: буферизацией соли Хэнка Решение (HBSS, Invitrogen), 0,2% (вес / объем) коллагеназы типа XI (Sigma -Aldrich), со средним показателем 3200 коллагена пищеварения единиц на мл HBSS; Dispase 2,4 units/1mL (Invitrogen), 0,5% (вес / объем) трипсина (Invitrogen).
4. Стерилизовать хирургическое оборудование на стадии подготовки: Хирургическая процедура требует стерильных хирургических инструментов, в том числе: разных размеров, пинцеты, микро-ножницы, ножницы диафрагмы и / или скальпелем лезвий. Кроме того, 15 и 50-мл полипропиленовые центрифужные пробирки (BD Falcon); сотовый фильтром (размер пор 70 м) (BD Falcon), 18 -, 23 - и 27-иглы (BD PrecisionGlide), а также 10 - или 20-мл стерильные шприцы (BD).

Шаг 2: биопсия тканей, изоляции и механической диссоциации ^1-4

Биопсия тканей выполняются под капотом стерильной культуры и включают свежесобранных сухожилий и скелетные мышцы получают из кости или камбаловидной мышцы задних конечностей от мышей дикого типа (Female C57BL/6J, 4-5 недельного возраста или моложе, Джексон лаборатории). Любые видимые соединительной ткани, кровеносных сосудов, и жировой ткани, которые затем удаляются из образцов биопсии. Ткани сухожилия и мышцы, затем тщательно, определенных в рамках хирургического вскрытия микроскопом, чтобы удалить остатки костей и кожи и помещена в блюдо с холодным (4 ° С) HBSS (дополнено добавить 5% FBS). Изолированной ткани затем отдельно размещены на коллаген покрытием блюд, содержащих холодного HBSS и будет фарш (<1х1 мм ³⁾ в грубой суспензии с использованием микро-ножницы и / или скальпелем лезвий.

Шаг 3: Ферментативное переваривание тканей:

Измельченной ткани затем ферментативно диссоциированных через ряд шагов, ^2,4,5

1. Передача фарш суспензии ткани на отдельные 15-мл пробирки и центрифуги при ~ 3500 оборотов в минуту при температуре 4 ° С в течение 5 мин.
2. Удалить супернатант, промойте HBSS и повторите снова центрифугирования.
3. Удалить супернатант, и переварить эти шламы, добавив 10 мл нагретого 0,2% коллагеназы типа XI (Sigma). Инкубировать 60 минут при 37 ° С при непрерывном осторожно покачайте его труб. Кроме того, трясти руками каждые 10 мин.
4. Центрифуга и ресуспендируйте этих шламов в 10 мл dispase (2,4 ед / мл, Gibco) решение. Инкубировать 45 минут при 37 ° С, потрясая руками или осторожно покачайте его каждые 10 мин.
5. Центрифуга и вновь приостановить эти шламы в 10 мл 0,2% раствора HBSS трипсина. Инкубационный будет меняться в зависимости от степени, в которой отдельные клетки освобождаются от тканей, которые могут быть выполнены с соблюдением подвески под микроскопом. Это не рекомендуют превышать 30 минут при 37 ° С с инверторным труб или осторожно покачайте его каждые 10 мин.
6. Центрифуга результате клеткаов и повторно приостанавливать осадок клеток в 10 мл распространения среднего (ТЧ).
7. Диссоциируют клеточной суспензии, передавая экстракта через ряд игл. Затем клетки прошли 2 раза через 18G, то 23G, и, наконец 27G иглу.
8. Pass клеточного экстракта через 70-мкм ячейки фильтра.

Шаг 4: Preplating для изоляции различных клеточных популяций на основе клеточной адгезии скоростью ^1-3

1. Центрифуга и ресуспендируйте ячейки гранул в нераспространении Средний.
2. Пластина ячейки смесей на коллаген покрытием Т-25 колбу (или 60 мм блюдо) и пометить его как PP1. Клеточной суспензии следует рассматривать как обладающие большим числом ядер преломления и другого мусора под микроскопом.
3. Инкубировать при 37 ° С в увлажненной, 5% СО ₂ инкубатора в течение 2 часов.
4. Передача nonadherent клетки нового коллагена покрытием Т-25 колбу (или 60 мм блюдо) и отметить его как PP2. Добавьте 5 мл PM в пластине помечены PP1. Рано придерживаясь клеток, которые прикрепляются к колбе в основном миофибробластов ^3.
5. Вернуться колб для инкубатора в течение еще 24 часов, передача nonadherent клетки нового коллагена покрытием Т-25 колбу (или блюдо) и пометить его как PP3. Добавьте 5 мл распространения среды в пластине помечены PP2. Эти присоединения клеток, которые придают этому колбу в основном фибробласты ^2,3.
6. Вернуться колб для инкубатора и повторить процедуру в другом 24 часа, пока население PP6 создается. Поддерживать каждой группы приостановлено клеток и позволяют им размножаться и рассматривая их регулярно использовать инвертированный микроскоп. PP3-PP4 в основном миобластов в то время как мышечные клетки спутниковой часто видели в основном в PP5 ^2.
7. Большинство медленно придерживаясь клетки обычно придают путем PP6. На данном этапе клетки появляются маленькие, круглые, светло-преломления и очень скудны по количеству и считаются населения стволовых клеток 1,2.

Шаг 5: Выявление и расширение изолированных стволовых клеток

1. Изолированных PP6 клетки очень мало, и их необходимо поддерживать в ФБС богатых распространения среднего (20% FBS в DMEM), который изменяется ежедневно. Большинство клеток в культуре PP6 умереть в течение следующих 1-2 недель культивирования, но большие, здоровые PP6 населения, как правило, созданные после еще 1-2 недели расширения. Стволовых клеток, выделенных из мышей высоко выразить стволовых клеток антигена 1 (SCA1), CD34, фетальные киназы печени 1 (Flk1) и другие маркеры стволовых ^1,2,6,7, которые могут быть визуализированы с помощью иммуноцитохимического окрашивания. Эти стволовые клетки также обладают несколькими возможностями дифференциации ^3,6,8.
2. Изолированных клеток сохраняется и расширены на низкой плотности клеток в культуре (12-а блюда в 50-100 клеток / лунку или <20-30% слияния в колбе или блюдо), чтобы избежать дифференциации ^1,2. Очень немногие клетки образуют клоны при расширении, и эти клонированные стволовые клетки могут перемещаться на большие распространения времени (ЛТП) для любых других исследований компетенции. Клонированные стволовые клетки также можно хранить в жидком азоте с использованием общих процедур хранения клетка например, ТЧ среде с 10% ДМСО. Сделать числа низкие запасы прохождения стволовых клеток для любых других исследований, до спины.

Обсуждение

Было признано, что некоторые взрослые ткани содержат множество стволовых клеток. За последние несколько лет обучения, стволовые клетки были обнаружены в мягких тканях опорно-двигательного аппарата, в том числе скелетные мышцы и сухожилия. Этот ток детали протокола процедура, известна...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	#11995-073
FBS	Invitrogen	#10437-028
Heat-inactivated horse serum	Invitrogen	#26050-088
Chick embryo extract	Accurate Chemical	#CE650T-10
100U ml penicillin/streptomycin	Invitrogen	#15140-122
Dulbecco's PBS	Invitrogen	#14190-250
Hank's Buffered Salt Solution	Invitrogen	#24020-117
Collagenase type XI 0.2%(wt/vol)	Sigma-Aldrich	#C7657
Dispase2.4U ml	Invitrogen	#17105-041
Trypsin-EDTA0.5%(wt/vol) (10x;5g liter trypsin (1:250)	Invitrogen	#15400-054
Collagen for coating flask : Type I collagen derived from calf skin 0.1 g liter	Sigma-Aldrich	#C-9791
DMSO	Sigma	#D-2650