Injektion eines. stephensi Embryonen zu generieren Malaria-resistenter Moskitos

Zusammenfassung

Anopheles stephensi Mücken sind Vektoren für Malaria bewohnen Indien und ganz Asien. Dieses Video zeigt die Technik für die Durchführung microinjections dieser Art mit Transgene, dass Widerstand gegen die Malaria, die Mücke wird zu verleihen. Ein großer Teil der Methodik in diesem Video gezeigt, ist für die Mikroinjektion Techniken anderer Mückenarten.

Zusammenfassung

Die Einführung von exogenen Genen in den Genomen von Moskitos erfordert Mikroinjektion Techniken abgestimmt auf die spezifischen Arten von Interesse. Dieses Video-Protokoll beschreibt eine Methode durch die James-Labor verwendet werden, um DNA-Konstrukte in Anopheles stephensi Embryonen für die Erzeugung von transformierten Mücken microinject. Techniken für die Herstellung Mikroinjektion Nadeln, Sammlung und Aufbereitung von Embryonen und die Durchführung der Mikroinjektion dargestellt.

Protokoll

Vorbereitung im Vorfeld der Mikroinjektion:

1. Blut ernähren Mücken: für die Injektion von Montag bis Mittwoch Feed Weibchen auf der vorigen Freitag. Um Donnerstag und Freitag, Futtermittel Frauen am Montag injizieren der gleichen Woche.
   
   
2. Bereiten Sie den Quartz Nadeln mit dem Programm 2 und isotonischen Puffer (siehe Materialien).
   
   
3. "Legen tube" für die Embryonen ist die regelmäßige Drosophila Kultur Durchstechflasche. Wet Watte in den Boden, mit einem nassen Scheibe Filterpapier für sie.
   
   
4. Bereiten Kunststoff Deckglas durch Kleben beidseitig Klebeband an einem Ende. Trim Band Deckglas, so dass es am Rande des Deckglases endet.
   
   
5. Bereiten Öl für Austrocknung.
   
   
6. Bereiten Sie eine Petrischale mit isotonischen Puffer, um Embryonen zu Schlüpfen zu übertragen.

Set up der erzwungenen Verlegung:

1. Sammeln 6-10 Blut zugeführt Weibchen mit dem Einsatz von einem Aspirator und übergeben sie an die Drosophila Kultur Fläschchen mit Baumwolle und Filterpapier nass mit isotonischen Puffer.
   
   
2. Die Mücken werden dann wieder in insectery Bedingungen in der Dunkelheit setzen und dürfen Eier für 1 h und 15 min lag.
   
   
3. Lassen Erwachsenen in den Käfig zu fliegen, und entfernen Sie das Filterpapier Festplatte mit Embryonen.
   
   
4. Um line up Eier, tun Sie es unter dem Binokular. Sammeln Trauben von Eiern mit einem feinen Pinsel (Sable, No 0000) und Transfer zum einen vorbereiteten Platz 3MM Whatman-Papier mit isotonischen Puffer getränkt. Schützen Sie das Papier alle Zeit nass. Lassen Sie sich nicht ausgetrocknet Eier zu bekommen. Entfernen Sie die exochorion mit dem Pinsel, hilft es, besser kleben Eier auf das Band.
   
   
5. Mit feinen ForceP Nr. 5 oder einem feinen Pinsel, abholen dunkleres Grau Embryonen und ordnen Linie auf Platz 3MM Whatman nass mit isotonischen Puffer. Line up von 20 bis 30 Embryonen. Alle Embryonen müssen in der gleichen Ausrichtung wie Injektion auf hinteren Pol sein. Das vordere Ende des Embryos ist etwas breiter als der hintere. Dann, mit Streifen 3MM Whatman-Papier, trockenes Filter in denen die Eier durch starken Druck auf beiden Seiten des Eies Linie nicht berühren, werden die Eier gefüttert.
   
   
6. Zur Übertragung der Eier, drehen Sie die Folie mit dem doppelseitigen Klebeband (Medizin), und sanft gegen die Eier zu drücken. Das hintere Ende der Eier müssen sehr nah an den Rand des doppelseitigem Klebeband. Die Nässe des Papiers ist entscheidend dafür, ob es zu nass werden sie nicht halten wird. Ich weiß Austrocknung des Embryos von 5-10 Sekunden, aber Austrocknung hängt von feuchten und Temperatur in Mikroinjektion Raum.
   
   
7. Austrocknung ist entscheidend für Eier: etwas zu viel und Embryonen nicht schlüpfen. Ohne Austrocknung DNA wird nicht in Embryos.
   
   
8. Abdeckung ausgetrocknet Embryonen mit Halocarbonöl weitere Austrocknung zu verhindern.

Mikroinjektion der Embryonen:

Der wichtigste Aspekt guter Injektion wird die Qualität der Nadel (siehe Anmerkung).

1. Füllen Sie eine Nadel mit der DNA-Lösung, um mit Hilfe eines Microloader (Eppendorf # 5242 956,003) injiziert werden. Sehr wenig Injektion soliution benötigt wird, von 1 bis 2 ml.
   
   
2. Schließen Sie die Nadel auf die Eppendorf Transjector, die Einspritzzeit und Druck steuert, sowie der Gegendruck. Mikroinjektion wird mit einem Mikroskop mit einer beweglichen Bühne (Leica) bei 10facher Vergrößerung und Mikromanipulator (Leica). Falls erforderlich, kann eine erhöhte Mikroskoptisch durch Stapeln 05.04 Objektträger vorbereitet werden. Legen Sie das Deckglas tragen die Embryonen auf die erhöhte Bühne. Die Embryonen werden in einem 150 ° Winkel injiziert; Penetration sollte am hinteren Pol sein. Für die Injektion, halte ich die Nadel stationär und bewegen die Bühne des Mikroskops. Wenn die Nadel neu ist, ist die Spitze verschlossen und in der Regel bricht in der ersten Injektion. Ich arbeite immer aus den Druck benötigt wird, um ein kleines Tröpfchen von DNA in Öl zu vertreiben, zwischen jeder Injektion.
   
   
3. Ich habe die Einspritzzeit um 0,2 bis 0,9 sec und 1000 hPa, wenn die Nadel ist neu. Ich variieren den Druck und die Zeit, bis ein kleiner Tropfen ist zu sehen, die sich aus der Nadel in das Öl. Der Gegendruck muss rund 100 eingestellt werden. Wie der Nadelspitze wird getragen hat den Einspritzdruck reduziert werden, um das Injektionsvolumen niedrig (ca. 300 hPa) zu halten. Danach wird die Nadelspitze zu groß und tötet die meisten der Embryonen.
   
   
4. Nach der Injektion zu entfernen das Öl mit Seidenpapier und decken die Rutsche mit Embryonen und in der Petrischale mit isotonischen Puffer. Die Schalen werden in der Insektarium und sie dort lassen, bis die Embryonen schlüpfen. Sie fangen an, nach 2-6 Tagen ausbrüten. Übertragen Sie die Larven in destilliertes Wasser mit der Prise gemahlener Fischfutter.

Hinweise

DNA für die Injektion: Plasmid-DNA-Lösung zur Injektion wurde unter Verwendung Endofree Plasmid-Kit.Construct Plasmid und Helferplasmids vermischen sich in richtigen Konzentration, mit Isopropanol gefällt. Das Pellet wurde mit 70% Ethanol, bevor Resuspendieren in Injektionspuffer gewaschen. Vor der Injektion, saubere DNA mit Millex-GV-Spalte.

Izotonic Puffer:

1,68 m NaCl - 88,3 ml 1,68 m NaCl - 2,9 m 1 M Hepes -10,7 ml 1,12 m CaCl 2 bis 2,2 ml dH 2 O - 896 ml

OR

5 M NaCl - 29,67 ml 1 M KCl - 4.87 ml 1 M Hepes - 10,7 ml 1,12 m CaCl 2 bis 2,2 ml dH 2 O - 952,56 ml

Passen Sie auf pH 7,2

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Injection Quartz needles		Sutter Instrument Co.		O.D.- 1.0 mm, I.D.-0.70, 10 cm length, are prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 mm micropipette puller.
Quartz puller	Tool	Sutter Instrument Co.	P-2000	Set-up: Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141
EndoFree plasmid kit		Qiagen
Isopropanol
Millex-GV column			SLGV RO4 NL	for DNA cleaning
Construct DNA				0.5 mg/ml
Helper plasmid				0.3 mg/ml
Injection solution	Buffer			1x solution: 5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8
Isotonic buffer				see recipe in the protocol section
Dessication oil				Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1). Mix well. Prepare in advance of microinjection.
Blood				to feed mosquitos
Anopheles stephensi	Animal			Mosquitos, male and female.
Drosophila culture vial				for egg laying
Petri dishes				with isotonic buffer, for embryo hatching
Fine paintbrush				Sable # 0000
3MM Whatman paper
Forceps #5
double sided tape
Microloader		Eppendorf	5242 956.003
Transjector		Eppendorf
Microscope		Leica Microsystems		with moving stage and micromanipulator, set at 10x magnification