Uma injeção de. Embriões stephensi para gerar malária resistente a mosquitos

Resumo

Mosquitos Anopheles stephensi são vetores da malária e da Índia que habitam em toda a Ásia. Este vídeo demonstra a técnica para a realização de microinjeções desta espécie com transgenes que conferem resistência à malária para o mosquito. Grande parte da metodologia demonstrada neste vídeo é aplicável às técnicas de microinjeção de outras espécies de mosquito.

Resumo

A introdução de genes exógenos em genomas de mosquitos exige técnicas de microinjeção sob medida para as espécies de interesse específicos. Este protocolo de vídeo demonstra um método utilizado pelo laboratório de James para microinject constrói DNA em embriões de Anopheles stephensi para a geração de mosquitos transformada. Técnicas de preparação agulhas microinjeção, coleta e preparação de embriões e na execução da microinjeção são ilustradas.

Protocolo

Preparação antes da microinjeção:

1. Mosquitos alimentam de sangue: para injeção de segunda a quarta-feira fêmeas alimentam na sexta-feira anterior. Para injetar quinta-feira e sexta-feira, as fêmeas se alimentam de segunda-feira da mesma semana.
   
   
2. Prepare as agulhas de quartzo usando o programa 2 e tampão isotônica (veja Materiais).
   
   
3. "Deitado tubo" para os embriões é o frasco de cultura regulares Drosophila. Algodão molhado no fundo, com um disco de papel de filtro molhado cobrindo-o.
   
   
4. Prepare lamínula de plástico furando a fita dupla face a um fim. Fita guarnição para cobrir deslizamento de modo que termina na borda da lamínula.
   
   
5. Prepare óleo para dessecação.
   
   
6. Prepare uma placa de Petri com tampão isotônica para transferir os embriões para incubação.

Criação de imposição forçada:

1. Coletar sangue 10/06 fêmeas alimentados com o uso de um aspirador e transferi-los para o frasco de cultura Drosophila com algodão e papel de filtro molhado com tampão isotônica.
   
   
2. Os mosquitos são então colocados de volta em condições insectery no escuro e permitiu a pôr ovos por 1 hora e 15 min.
   
   
3. Vamos voar adultos na gaiola e retire o disco de papel filtro com embriões.
   
   
4. Para alinhar os ovos, fazê-lo no âmbito de dissecação. Coletar cachos de ovos com um pincel fino (Sable, No 0000) e transferir para um quadrado de papel Whatman preparado 3MM embebido com tampão isotônica. Mantenha o papel o tempo todo molhado. Não deixe que os ovos se desidratado. Remover o exocório com o pincel, que ajuda a melhor vara de ovos para a fita.
   
   
5. Usando pinça fina No. 5 ou um pincel fino, pegar embriões cinza escuro e organizar em linha na praça da Whatman 3MM molhado com tampão isotônica. Line up 20-30 embriões. Todos os embriões devem estar na mesma orientação que a injeção tem que ser no pólo posterior. A extremidade anterior dos embriões é ligeiramente mais largo que o posterior. Em seguida, usando tiras de papel Whatman 3MM, secar o filtro onde os ovos estão alinhados pressionando duro em ambos os lados da linha de ovos, não tocando os ovos.
   
   
6. Para transferir os ovos, inverter o slide que contém a fita dupla face (Medicina), e pressione suavemente contra os ovos. A extremidade posterior dos ovos tem que ser muito perto da borda da fita dupla face. A umidade do papel é fundamental para isso, se ele estiver muito molhada que não vai aderir. Eu faço dessecação dos embriões a partir de segunda 10/05, mas o tempo dessecação depende da umidade e da temperatura na sala de microinjeção.
   
   
7. Dessecação é fundamental para os ovos: pouco demais e embriões não chocarão. Sem DNA dessecação não está entrando em embrião.
   
   
8. Cobrir com óleo de embriões dessecados halocarbono prevenir o dessecamento mais.

Microinjeção de embriões:

O aspecto mais importante da injeção de bom é a qualidade da agulha (ver nota).

1. Preencher uma agulha com a solução de DNA a ser injetado através de um microloader (Eppendorf # 5242 956,003). Muito soliution injeção pouco é necessário, 1 a 2 ml.
   
   
2. Conecte a agulha para a Transjector Eppendorf, que controla o tempo de injeção e pressão, bem como a contrapressão. Microinjeção é realizada utilizando um microscópio com um palco em movimento (Leica) na ampliação x 10 e micromanipulador (Leica). Se necessário, um estágio do microscópio levantadas podem ser preparados pelo empilhamento de lâminas de microscópio 4-5. Coloque a lamínula carregando os embriões em estágio elevado. Embriões são injetados em um ângulo de 150; penetração deve ser no pólo posterior. Injectável, eu continuo a agulha estacionário e move o estágio do microscópio. Quando a agulha é nova, a dica é fechado e geralmente quebra na primeira injeção. Eu sempre trabalho com a pressão necessária para expulsar uma pequena gota de DNA em óleo entre cada injeção.
   
   
3. Eu definir o tempo de injeção para 0,2-0,9 sec e 1000 hPa quando a agulha é nova. Eu variar a pressão e tempo até que uma pequena gota é visto saindo da agulha no óleo. A contrapressão deve ser definido em torno de 100. Como a ponta da agulha fica gasta, a pressão de injeção deve ser reduzida para manter o baixo volume de injeção (cerca de 300 hPa). Após isso, a ponta da agulha é muito grande e está matando a maioria dos embriões, o.
   
   
4. Após a injeção, retire o óleo com papel de seda e cobrir a lâmina com embriões e coloque no prato de Petri com tampão isotônica. Coloque os pratos na insectory e deixá-los lá até os embriões hatch. Eles começam a eclodir após 2-6 dias. Transferência das larvas para água destilada com a pitada de comida de peixe chão.

Notas

DNA injectável: solução de DNA plasmidial para injeção foi isolado utilizando kit plasmídeo EndoFree.Construção de plasmídeo e misture Helper plasmídeo juntos em concentração correta, precipitado com isopropanol. O pellet foi lavado com etanol 70% antes de ressuspender em tampão de injeção. Antes da injeção, usando DNA limpa Millex-GV coluna.

Tampão Izotonic:

1,68 M NaCl - 88,3 ml 1,68 M NaCl - 2,9 m 1 M Hepes -10,7 ml 1,12 M CaCl 2-2,2 ml dH 2 O - 896 ml

OR

5 M NaCl - 29,67 ml 1 M KCl - 4,87 ml 1 Hepes M - 10,7 ml 1,12 M CaCl 2-2,2 ml dH 2 O - 952,56 ml

Ajustar o pH 7,2

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Injection Quartz needles		Sutter Instrument Co.		O.D.- 1.0 mm, I.D.-0.70, 10 cm length, are prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 mm micropipette puller.
Quartz puller	Tool	Sutter Instrument Co.	P-2000	Set-up: Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141
EndoFree plasmid kit		Qiagen
Isopropanol
Millex-GV column			SLGV RO4 NL	for DNA cleaning
Construct DNA				0.5 mg/ml
Helper plasmid				0.3 mg/ml
Injection solution	Buffer			1x solution: 5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8
Isotonic buffer				see recipe in the protocol section
Dessication oil				Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1). Mix well. Prepare in advance of microinjection.
Blood				to feed mosquitos
Anopheles stephensi	Animal			Mosquitos, male and female.
Drosophila culture vial				for egg laying
Petri dishes				with isotonic buffer, for embryo hatching
Fine paintbrush				Sable # 0000
3MM Whatman paper
Forceps #5
double sided tape
Microloader		Eppendorf	5242 956.003
Transjector		Eppendorf
Microscope		Leica Microsystems		with moving stage and micromanipulator, set at 10x magnification